一种无血清肝细胞培养基及其制备方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养用培养基，具体涉及一种无血清肝细胞培养基及其制备方法。本发明专利技术培养基包含基础培养基和添加组分，其中所述添加组分包括：胰岛素，转铁蛋白，亚硒酸钠，表皮生长因子，肝细胞生长因子，层粘连蛋白，地塞米松，非酯化脂肪酸，碳酸氢钠，丹参酮ⅡA和隐丹参酮。本发明专利技术培养基能够促进细胞的生长，并且意外地发现本发明专利技术无血清肝细胞培养基能够大量促进白蛋白的合成，能够长时间维持细胞活力。

【技术实现步骤摘要】
一种无血清肝细胞培养基及其制备方法
本专利技术涉及细胞培养用培养基，具体涉及一种用于肝细胞培养的无血清培养基及其制备方法。
技术介绍
肝脏作为人体中最重要的器官之一，承担着合成、分泌、代谢、解毒等多种复杂的功能。一旦由各种原因造成肝细胞的大量坏死，将会出现肝衰竭，导致机体代谢紊乱和毒性物质的堆积，而这反过来又加重了肝细胞的损伤，影响肝细胞的再生，进而形成肝衰竭的恶性循环。急性肝功能衰竭是一种严重的肝脏疾病，死亡率高达60～90％。目前，对此最有效的治疗方法为肝脏移植。然而，由于供体器官缺乏、费用高昂、需长期使用免疫抑制剂等原因，往往在等待供体过程中，病人由于病情进展而迅速死亡，极大地限制了肝移植手术的广泛开展。因此，以培养肝细胞为基础的生物型人工肝技术成为终末期肝病患者向原位肝移植顺利过渡、以及给急性肝功能衰竭患者受损肝脏提供得以再生和修复时机的重要手段。随着肝细胞分离、培养技术的发展，体外培养的肝细胞能维持数小时的代谢活力，执行许多肝脏的代谢和解毒功能。由于肝移植供肝的严重短缺，利用体外培养的肝细胞进行细胞移植和构建生物人工肝(bioartificialliversystems，BAL)来治疗急性或慢性肝功能衰竭患者的方法正日益受到关注。目前在肝细胞体外培养中通常使用添加10％(v/v)胎牛血清(FBS)的William’s-E培养基。然而，血清中的成分十分复杂，其中存在的未知物质和可变因素往往影响研究结果和治疗效果的准确性和重复性。另外，FBS等动物血清或血清蛋白等动物源成分进入人体后会引发多种不良反应及疾病，为细胞移植和BAL治疗的临床应用埋下了隐患。美国FDA即将停止受理用含血清细胞培养工艺的医疗技术以及制备的生物技术新药的申报。无血清培养已经成为生物技术制药生产和生物医学工程临床治疗的总趋势。中国专利申请(CN105087465A)公布了一种肝细胞无血清培养基，其包括以下组分：基础培养基500mL；丝胶蛋白0.05～0.5％；地塞米松0.1～1000nmol/mL；肝细胞生长因子5～20ng/mL；表皮生长因子10～50ng/mL；青链霉素100U/mL，此专利申请主要结合了丝胶蛋白的优势。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种无血清肝细胞培养基，其能够促进细胞的生长，并且能够大量促进白蛋白的合成，能够长时间维持细胞活力。本专利技术还提供了一种无血清肝细胞培养基的制备方法。本专利技术通过以下技术方案实现：一种无血清肝细胞培养基，包含基础培养基和添加组分，添加组分由以下成分及其浓度组成：胰岛素1-15mg/mL，转铁蛋白1-10mg/L，亚硒酸钠6-12μg/L，表皮生长因子10-100μg/L，肝细胞生长因子15-100ng/mL，层粘连蛋白0.5-0.85μg/mL，地塞米松1-10mmol/L，非酯化脂肪酸0.1-0.5mmol/L，碳酸氢钠1-3g/L，丹参酮ⅡA10-50μg/L和隐丹参酮1-10μg/L。优选地，所述非酯化脂肪酸由油酸，硬脂酸和棕榈油酸的组合物，各成分所占重量比为油酸35％，硬脂酸35％，棕榈油酸30％。优选地，所述非酯化脂肪酸为亚油酸，油酸、软脂酸和硬脂酸的组合物，各成分所占比例为亚油酸20％，油酸45％，软脂酸25％和硬脂酸10％。优选地，所述基础培养基为DMEM/F12，DEME或RPMI1640培养基。一种无血清肝细胞培养基制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)准确称取基础培养基，胰岛素，转铁蛋白，亚硒酸钠，表皮生长因子，肝细胞生长因子和层粘连蛋白溶于灭菌后的超纯水中，搅拌均匀，得溶液I；(2)准确称取地塞米松溶于10mL无水乙醇中，然后用超纯水稀释100倍，得溶液II；(3)按比例准确称取非酯化脂肪酸后，溶于10mL无水乙醇中，搅拌均匀，得溶液III；(4)将溶液II和溶液III加入溶液I中，并加入碳酸氢钠，搅拌均匀，得溶液IV；(5)将溶液IV用0.22μM无菌滤膜过滤，即得。本专利技术培养基所添加的各组分是通过大量科学实验筛选得到的。其中，胰岛素主要作用是增加细胞内的cAMP水平，促进葡萄糖、氨基酸利用，同时促进肝细胞内的RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，从而增强肝细胞的活力与功能。转铁蛋白通常和胰岛素、硒元素共同添加，简称ITS添加物，是大部分无血清培养基所必需的补充因子。转铁蛋白的主要作用为调节体内铁元素的代谢，通过细胞表面的转铁蛋白受体将铁元素转移到细胞内。亚硒酸钠作为人体的必需微量元素硒的存在形式，起到保护细胞免受氧化应激的作用。表皮生长因子和肝细胞生长因子的主要作用为促进肝细胞的增殖，以及调节肝细胞的功能。层粘连蛋白的主要作用为促进肝细胞的粘附，及其贴壁生长。地塞米松是体内重要的激素，参与肝细胞的糖代谢、脂类代谢等，能调节肝细胞的增殖与功能表达。本专利技术培养基中添加有非酯化脂肪酸，已有研究证明非酯化脂肪酸对肝细胞具有调控作用。在本专利技术培养中，筛选出的油酸，硬脂酸和棕榈油酸组合物或亚油酸，油酸、软脂酸和硬脂酸的组合物添加到培养基中均能够显著地促进干细胞的生长。丹参酮ⅡA是丹参的一种醇溶性成分，是天然的抗氧化剂。丹参酮ⅡA作为一种有效的细胞内脂质过氧化物与DNA相互作用的抑制剂，能消除线粒体脂质过氧化过程中产生的脂质自由基，从而能消除线粒体的吸收功能。与此同时，有研究证明丹参酮ⅡA能够改善TNF-α和H2O2所致体外培养肝细胞株的损伤。本专利技术意外地发现，当在培养基中加入10-50μg/L浓度范围内的丹参酮ⅡA和1-10μg/L浓度范围内的隐丹参酮不仅能够有效地抑制培养基内微生物地生长和病毒地感染，并且能够明显促进白蛋白的合成。本发无血清肝细胞培养基与现有培养基相比，具有能够促进细胞的生长，并能够大量促进白蛋白的合成，能够长时间维持细胞活力的优势。附图说明图1不同培养基中肝细胞活力测定：培养基为实施例1-2及对比例1-3制备得到的培养基。图2不同培养基中白蛋白(ALB)含量：培养基为实施例1-2及对比例1-3制备得到的培养基。图3不同培养基中ALT(丙氨酸转氨酶)含量：培养基为实施例1-2及对比例1-3制备得到的培养基。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明，但这并非是对本专利技术的限制，本领域技术人员根据本专利技术的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本专利技术的基本思想，均在本专利技术的范围之内。本专利技术所需药品为常规药品，丹参酮ⅡA、隐丹参酮购于南京景竹医药科技有限公司。实施例1一种无血清肝细胞培养基一种无血清肝细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：DMEM/F1235g/L，胰岛素8.65mg/mL，转铁蛋白5.74mg/L，亚硒酸钠8.2μg/L，表皮生长因子69μg/L，肝细胞生长因子78ng/mL，层粘连蛋白0.71μg/mL，地塞米松7.9mmol/L，油酸0.112mmol/L，硬脂酸0.112mmol/L，棕榈油酸0.096mmol/L，碳酸氢钠1.5g/L，丹参酮ⅡA45μg/L和隐丹参酮4.3μg/L。本专利技术无血清肝细胞培养基制备方法，分为以下步骤：(1)准确称取基础培养基，胰岛素，转铁蛋白，亚硒酸钠，表皮生长因子，肝细胞生长因子和层粘连蛋白溶于灭菌后的超纯水中，搅拌均匀，得溶液I；(2)准确称取地本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无血清肝细胞培养基，其特征在于：包含基础培养基和添加组分，添加组分由以下成分及其浓度组成：胰岛素1‑15mg/mL，转铁蛋白1‑10mg/L，亚硒酸钠6‑12μg/L，表皮生长因子10‑100μg/L，肝细胞生长因子15‑100ng/mL，层粘连蛋白0.5‑0.85μg/mL，地塞米松1‑10mmol/L，非酯化脂肪酸0.1‑0.5mmol/L，碳酸氢钠1‑3g/L，丹参酮ⅡA 10‑50μg/L和隐丹参酮1‑10μg/L。

【技术特征摘要】
1.一种无血清肝细胞培养基，其特征在于：包含基础培养基和添加组分，添加组分由以下成分及其浓度组成：胰岛素1-15mg/mL，转铁蛋白1-10mg/L，亚硒酸钠6-12μg/L，表皮生长因子10-100μg/L，肝细胞生长因子15-100ng/mL，层粘连蛋白0.5-0.85μg/mL，地塞米松1-10mmol/L，非酯化脂肪酸0.1-0.5mmol/L，碳酸氢钠1-3g/L，丹参酮ⅡA10-50μg/L和隐丹参酮1-10μg/L。2.根据权利要求1所述无血清肝细胞培养基，其特征在于，所述非酯化脂肪酸由油酸，硬脂酸和棕榈油酸的组合物，各成分所占重量比为油酸35％，硬脂酸35％，棕榈油酸30％。3.根据权利要求1所述无血清肝细胞培养基，其特征在于，所述非酯化脂肪酸为亚油酸，油酸、软脂酸和硬脂酸的组合物，各...

【专利技术属性】
技术研发人员：严志海，
申请(专利权)人：严志海，
类型：发明
国别省市：广东,44