一种应用磷脂酶C将胞内蛋白在胞外表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种应用磷脂酶C将胞内蛋白在胞外表达的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术通过共表达磷脂酶C，使胞内定位蛋白以非特异渗漏的方式释放到细胞外，筛选获得高性能的磷脂酶C和目标蛋白胞外酶活较高的共表达重组菌。蔗糖磷酸化酶与磷脂酶C共表达的重组菌胞外蔗糖磷酸化酶的酶活为1445.1U·mL

【技术实现步骤摘要】
一种应用磷脂酶C将胞内蛋白在胞外表达的方法
本专利技术涉及一种应用磷脂酶C将胞内蛋白在胞外表达的方法，属于生物工程

技术介绍
大肠杆菌(Escherichiacoli)表达系统作为目前应用最广泛、研究最透彻的表达系统之一，在培养周期长短、实验操作简便度等方面具有显著优势。由于大肠杆菌具有两层的细胞膜结构，外源基因在大肠杆菌表达系统中的表达产物可能定位于大肠杆菌空间结构的不同位置，通常有三种定位方式：胞内、胞外和周质空间定位。有研究发现，当天然胞内定位的蛋白在大肠杆菌表达系统重组表达时，即使给目的蛋白添加信号肽，也不能穿过大肠杆菌的细胞膜分泌到细胞外。这些蛋白通常只能在细胞内进行表达并且需要利用物理或化学方法对细胞进行破碎才能获得目的蛋白，后续提取工艺不但繁琐而且成本较高，因此寻找能够有效的简化下游提取步骤降低产物纯化的成本成为了研究者的目标。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达磷脂酶C；所述磷脂酶C的氨基酸序列如SEQIDNO.1-3任一所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌共表达磷脂酶C与目标蛋白；所述目标蛋白是胞内蛋白，该基因工程菌能够使胞内蛋白在胞外表达。在专利技术的一种实施方式中，三种磷脂酶C基因分别来源于Listeriamonocytogenes、Clostridiumperfringens和Bacilluscereus。在本专利技术的一种实施方式中，所述目标蛋白是胞内定位蛋白；所述胞内定位蛋白是在伴侣蛋白的辅助下，合成于核糖体后仍定位在细胞基质中的蛋白。在本专利技术的一种实施方式中，所述目标蛋白包括蔗糖磷酸化酶，海藻糖酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述磷脂酶C与目标蛋白是以pETDuet-1为载体进行共表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以E.coliBL21(DE3)为宿主。本专利技术的第二个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，是将编码磷脂酶C的基因和编码目标蛋白的基因分别连接到pETDuet-1表达载体的多克隆位点MCS1或MCS2上，得到重组表达质粒，然后将重组质粒转化到宿主菌中。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码磷脂酶C的基因包括SEQIDNO.4-6。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主菌为E.coliBL21(DE3)。本专利技术的第三个目的是提供一种将胞内蛋白在胞外表达的方法，是将磷脂酶C分别与目标蛋白在大肠杆菌中共表达；所述磷脂酶C的氨基酸序列分别为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。本专利技术的第四个目的是提供一种生产胞外蛋白的方法，所述方法是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，离心，收集发酵上清液。在本专利技术的一种实施方式中，具体是：(1)分别将基因序列如SEQIDNO.4-6所示的三种磷脂酶C基因和蔗糖磷酸化酶基因连接到pETDuet-1表达载体的多克隆位点MCS1或MCS2上，得到重组表达质粒，(2)将重组质粒转化到宿主菌，(3)对重组菌进行发酵培养，收集发酵上清液。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体为pETDuet-1，所述宿主菌为E.coliBL21(DE3)。在本专利技术的一种实施方式中，所述目标蛋白为胞内定位蛋白；所述胞内定位蛋白是在伴侣蛋白的辅助下，合成于核糖体后仍定位在细胞基质中的蛋白。在本专利技术的一种实施方式中，所述目标蛋白包括蔗糖磷酸化酶，海藻糖酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：(1)将SEQIDNO.4-6所示不含信号肽的磷脂酶C成熟蛋白基因以及蔗糖磷酸化酶基因，连接至pMD19-Tsimplevector，获得质粒pMD19T-plc(以plc代表三种磷脂酶C)和pMD19T-sp；(2)分别对表达载体pETDuet-1和上步构建成功的pMD19T-plc或pMD19T-sp质粒进行双酶切，将不同的目的基因分别连接到表达载体pETDuet-1的多克隆位点MCS1，转化E.coliJM109感受态细胞，得到重组质粒pETDuet-1-plc和pETDuet-1-sp。(3)分别对含有sp和plc基因的质粒以及上步构建的pETDuet-1-plc和pETDuet-1-sp进行双酶切，将sp或plc分别连接到重组质粒pETDuet-1-plc和pETDuet-1-sp的多克隆位点MCS2，转化E.coliJM109感受态细胞，得到共表达质粒pETDuet-1-plc-sp和pETDuet-1-sp-plc。(4)将步骤(3)构建的共表达质粒pETDuet-1-plc-sp和pETDuet-1-sp-plc分别导入宿主大肠杆菌，获得六株重组菌；(5)发酵培养步骤(4)构建的重组大肠杆菌生产目标蛋白，收集发酵上清液。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养具体是：将种子以8-10％的接种量接种，诱导前培养温度为37℃，诱导后培养温度30℃，pH6.5-7.5，溶氧20-30％；当发酵初始碳源甘油基本消耗完时，开始流加补料液，所述补料液按指数流加，比生长速率控制在μ＝0.1-0.3h-1；当菌体细胞浓度达到OD600为30-50时，开始诱导，诱导方法为恒速流加乳糖，乳糖加量0.1-0.4g·L-1·h-1，测定菌体干重和培养基中酶活变化，培养基中酶活不再上升时，发酵过程结束。在此条件下进行发酵培养，能够使胞内定位目标蛋白分泌到胞外。有益效果：本专利技术通过共表达磷脂酶C，使大肠杆菌细胞膜透性提高，可以使胞内定位蛋白以非特异渗漏的方式释放到细胞外，筛选获得高性能的磷脂酶C和目标蛋白胞外酶活较高的共表达重组菌。蔗糖磷酸化酶与磷脂酶C共表达的重组菌胞外蔗糖磷酸化酶的酶活为1445.1U·mL-1，而单独表达的重组菌胞外未检测到蔗糖磷酸化酶酶活；海藻糖酶与磷脂酶C共表达的重组菌胞外海藻糖酶的酶活为322.3U·mL-1，而单独表达的重组菌胞外未检测到海藻糖酶酶活。在食品、化妆品及医药行业有广泛的应用价值,国内外市场需求较大。附图说明图1为重组质粒的构建过程；a，pETDuet-1-lstplc-sp；b，pETDuet-1-sp-lstplc；图2为重组菌的生物量和产酶曲线；其中，a，E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-lstplc-sp；b，E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-sp-lstplc；图3为重组菌SDS-PAGE凝胶电泳图；其中，a，E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-lstplc-sp；b，E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-sp-lstplc；M，Marker；1-3分别为E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-lstplc-sp的发酵上清液、破壁上清液和破壁沉淀；4-6分别为E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-sp-lstplc的发酵上清液、破壁上清液和破壁沉淀；图4为重组菌的生物量和产酶曲线；其中，a，E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-cpplc-sp；b，E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-sp-cpplc；■，菌体干重；▲，胞外上清酶活；●，总酶活；图5为重组菌的SDS-PAGE凝胶电泳图；其中，a，E.coliBL2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达磷脂酶C；所述磷脂酶C的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑3任一所示。

【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达磷脂酶C；所述磷脂酶C的氨基酸序列如SEQIDNO.1-3任一所示。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，还共表达目标蛋白；所述目标蛋白是胞内定位蛋白；所述胞内定位蛋白是在伴侣蛋白的辅助下，合成于核糖体后仍定位在细胞基质中的蛋白。3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述目标蛋白包括蔗糖磷酸化酶，海藻糖酶。4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述磷脂酶C与目标蛋白是以pETDuet-1为载体进行共表达；所述基因工程菌以E.coliBL21(DE3)为宿主。5.构建权利要求2所述基因工程菌的方法，其特征在于，将编码磷脂酶C的基因和编码目标蛋白的基因分别连接到pETDuet-1表达载体的多...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，宿玲恰，于林港，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32