一种猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌及其构建方法技术

一种猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌及其构建方法，属于动物细菌基因工程技术领域。本发明专利技术减毒载体菌为缺失了Δ

【技术实现步骤摘要】
一种猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌及其构建方法
本专利技术属于动物细菌基因工程

技术介绍
基因工程方法致弱的鼠伤寒沙门氏菌作为载体表达外源基因，广泛用于人类和动物的各种疾病的治疗研究，取得了良好效果。但是在许多报道中的沙门氏菌载体，要么使减毒载体过度减毒，失去了免疫原性，或者虽保留了良好的免疫原性，但是载体菌株却减毒不够，缺乏安全性。猪霍乱沙门氏菌是猪的重要病原菌。关于以猪霍乱沙门氏菌为载体递送猪的其他病原抗原的研究，在国内外已有少量报道，如：华中农业大学的陈焕春院士实验室以猪霍乱沙门氏菌中国弱毒疫苗标准株C500为载体递送猪肺炎支原体抗原；军事医学科学院军事兽医研究所的涂长春实验室利用猪霍乱沙门氏菌中国弱毒疫苗标准株C500为载体递送猪瘟病毒的抗原。这些研究结果都有如下的共同点：一是这些候选疫苗株对猪霍乱沙门氏强毒株的攻毒（攻毒剂量>10×LD50）可以产生100%的保护；二是对外源病原的攻毒虽然有一定的作用，但是保护效率不够理想。其原因可能是使用了猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗标准株C500为载体，虽然猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗标准株C500对宿主足够减毒，但是其产生的免疫原性似乎还不足以诱导理想的针对外源抗原的免疫反应。因此迫切需要研制一种疫苗载体，既要使疫苗载体足够减毒，保证动物完全的安全性，又要使疫苗载体能诱导出优秀免疫原性，高质量地抗击载体菌和其携带的外源抗原的病原感染。本实验室在前期研究过程中发现，用阿拉伯糖调控猪霍乱沙门氏菌的crp毒力基因所产生的减毒载体菌（中国专利申请CN104498418A）可以诱导出对成年BALB/c小鼠较好的免疫原性，但是减毒株免疫后，用高剂量20×LD50的野生型猪链球菌2型（SS2）比用10×LD50的SS2攻毒的保护效率低，同时减毒株在小鼠的肝脏和脾脏仍然有减毒菌株的复制，表明作为减毒株的安全性和免疫原性还存在一定的风险和不足。sopB基因是由沙门氏菌SPI-1编码，该基因的敲除能够减少鼠伤寒沙门氏菌引起宿主肠道的炎性反应，减少鼠伤寒沙门氏菌对宿主免疫系统的应激，减轻对宿主免疫系统的损伤，从而提高对宿主的安全性，同时，可以提高宿主对鼠伤寒沙门氏菌和其携带的外源抗原的免疫原性。不同动物有不同易感的沙门氏菌，反之，同一种沙门氏菌对于不同动物也有不同的致病性，其所含的毒力基因的作用也会不同。在猪霍乱沙门氏菌中缺失sopB基因，是否会达到相同的降低猪霍乱沙门氏菌感染导致的炎症反应，提高猪霍乱沙门氏菌对猪的免疫原性，到目前为止国内外还未见报过。
技术实现思路
针对现有技术缺陷，本专利技术目的在于提供一种具有安全性较高和免疫原性较强的特点的猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌。本专利技术所述减毒载体菌为缺失了ΔmanA、Δcrp::TTaraCPBAD、ΔrelA::araCPBADlacITT、ΔsopB和ΔasdA基因的C78-3猪霍乱沙门氏菌，命名为rSC0016。rSC0016保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏日为2016年6月20日，保藏编号为CGMCCNO.12645，该生物材料的分类命名为:减毒猪霍乱沙门氏菌,拉丁文学名为:Salmonellacholeraesuis。本专利技术以C78-3猪霍乱沙门氏菌为母体，在阿拉伯糖调控猪霍乱沙门氏菌载体毒力基因表达的基础上，由于敲除了猪霍乱沙门氏菌中的sopB基因，使载体菌具备减毒的安全特性时，提高载体菌诱导宿主的免疫原性的能力，使载体菌成为安全和高效保护性的疫苗株；同时敲除了载体菌的asd基因，使载体菌与其携带的原核表达外源抗原的asd+载体形成致死平衡系统，避免使用具有抗生素标记的原核表达载体。本专利技术达到了如下的有益效果：1、免疫原性强：将阿拉伯糖调控猪霍乱沙门氏菌载体毒力基因延迟缺失和延迟表达外源抗原的技术与敲除猪霍乱沙门氏菌引起宿主炎症的sopB基因方法相结合，使载体菌具备减毒的安全特性时，提高载体菌诱导宿主的免疫原性。实验证明，含有ΔsopB突变的rSC0016株比不含有ΔsopB的rSC0011株（ΔmanA、Δcrp::TTaraCPBAD、ΔrelA::araCPBADlacITT和ΔasdA）所诱导的免疫应答更好。例如：携带猪链球菌2型的SaoA蛋白的rSC0016(pS-SaoA)，可以100%抵抗高剂量的野生型猪链球菌2型的攻击，证明了rSC0016能够诱导出完美的免疫原性，这对于猪的各种疾病具有极大的市场应用性和创造出显著的经济效益。以上不含有ΔsopB的rSC0011株（ΔmanA、Δcrp::TTaraCPBAD、ΔrelA::araCPBADlacITT和ΔasdA）公布于2015年(ZhenyingJib,JingShangb,YuanLi,ShifengWang,HuoyingShi,LiveattenuatedSalmonellaentericaserovarCholeraesuisvaccinevectordisplayingregulateddelayedattenuationandregulateddelayedantigensynthesistoconferprotectionagainstStreptococcussuisinmice,Vaccine33(2015)4858–4867)。2、更高安全性：相比于不含有ΔsopB突变的rSC0011株（ΔmanA、Δcrp::TTaraCPBAD、ΔrelA::araCPBADlacITT和ΔasdA），本专利技术含有ΔsopB突变的rSC0016更加减毒，因而具有更高的安全性，适合作为疫苗载体免疫刚断奶的仔猪。本专利技术另一目的在于提供上述猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌的构建方法。本专利技术构建方法包括以下步骤：1）构建含ΔsopB突变基因的自杀载体：以猪霍乱沙门氏菌C78-3的基因组为模板，通过引物扩增同源臂片段，敲除猪霍乱沙门氏菌C78-3的基因序列中的sopB基因片段，并将敲除猪霍乱沙门氏菌C78-3的基因序列中的sopB基因片段后的片段基因连接至自杀质粒pRE112中，取得缺失ΔsopB基因序列自杀质粒；再将缺失ΔsopB基因序列自杀质粒转化至工程菌大肠杆菌χ7213中，制得含ΔsopB突变基因的自杀载体，命名为χ7213（pS006）；2）构建引入ΔsopB突变基因的rSC0013株：以缺失了ΔmanA、ΔPcrp::TTaraCPBADcrp和ΔrelA::araCPBADlacITT基因的C78-3猪霍乱沙门氏菌为受体菌，以含ΔsopB突变基因的自杀载体为供体菌，将供体菌和受体菌进行接合，经培养、纯化，取得引入ΔsopB突变基因的rSC0013株(ΔmanA，ΔPcrp::TTaraCPBADcrp，ΔrelA::araCPBADlacITT，ΔsopB）；3）构建猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌rSC0016：以引入ΔsopB突变基因的rSC0013株为受体菌，以含ΔasdA自杀载体χ7213(pS004)为受体菌，将供体菌和受体菌进行接合，经培养、纯化，取得猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌rSC0016。本专利技术采用无抗性标记的自杀载体作为构建猪霍乱沙门氏菌载体的方法，可以避免使用抗生素标记的载本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌，其特征在于：所述减毒载体菌为缺失了Δ

【技术特征摘要】
1.一种猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌，其特征在于：所述减毒载体菌为缺失了ΔmanA、Δcrp::TTaraCPBAD、ΔrelA::araCPBADlacITT、ΔsopB和ΔasdA基因的C78-3猪霍乱沙门氏菌。2.如权利要求1所述猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1）构建含ΔsopB突变基因的自杀载体：以猪霍乱沙门氏菌C78-3的基因组为模板，通过引物扩增同源臂片段，敲除猪霍乱沙门氏菌C78-3的基因序列中的sopB基因片段，并将敲除猪霍乱沙门氏菌C78-3的基因序列中的sopB基因片段后的片段基因连接至自杀质粒pRE112中，取得缺失ΔsopB基因序列自杀质粒；再将缺失ΔsopB基因序列自杀质粒转化至工程菌大肠杆菌χ7213中，制得含ΔsopB突变基因的自杀载体；2）构建引入ΔsopB突变基因的rSC0013株：以缺失了ΔmanA、ΔPcrp::TTaraCPBADcrp和ΔrelA::araCPBADlacITT基因的C78-3猪霍乱沙门氏菌为受体菌，以含ΔsopB突变基因的自杀载体为供体菌，将供体菌和受体菌进行接合，经培养、纯化，取得引入ΔsopB突变基因的rSC0013株；3）构建猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌：以引入ΔsopB突变基因的rSC0013株为受体菌，以含ΔasdA自杀载体χ7213(pS004)为受体菌，将供体菌和受体菌进行接合，经培养、纯化，取得猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌。3.根据权利要求2所述猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌的构建方法，其特征在于所述步骤1）中，以猪霍乱沙门氏菌C78-3的基因组为模板，由引物P1和P2经PCR扩增得pipC同源臂基因序列；以猪霍乱沙门氏菌C78-3的基因组为模板，由引物P3和P4经PCR扩增得pipD基因的同源臂序列；将pipC同源臂基因序列和pipD基因的同源臂序列以碱基长度1:1的比例混合制得混合产物；以混合产物作为模板，利用引物P1和引物P4进行OverlapPCR扩增得到长度为493bp的同源臂片段，并将该同源臂片段连接至pM18T克隆载体，转化之JM109感受态细胞，提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：石火英，李玉安，吉贞颖，尚竞，吕一帆，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32