一种重组弱毒肠炎沙门氏菌制造技术

本发明专利技术提供一种弱毒肠炎沙门氏菌rSD株，其保藏编号为CGMCC NO.13346。本发明专利技术所提供的弱毒肠炎沙门氏菌用于制备重组疫苗株。本发明专利技术另一个方面提供一种重组肠炎沙门氏菌活载体疫苗株，其基因组中包含IBDV的VP2基因。其中一个重组肠炎沙门氏菌活载体疫苗株的保藏编号为CGMCC NO.13251。本发明专利技术提供的弱毒肠炎沙门氏菌作为宿主所构建的重组疫苗株遗传稳定性好，在普通培养基连续传代20代，插入的外源基因没有发生任何突变；重组菌不含任何抗性，这符合现代细菌活疫苗的发展趋势，安全性好，不用考虑抗生素残留。重组菌生长繁殖性能良好，没有因为外源基因的插入而影响细菌的增殖。

【技术实现步骤摘要】
一种重组弱毒肠炎沙门氏菌
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种重组弱毒肠炎沙门氏菌。技术背景传染性法氏囊病(Infectionbursaldisease,IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病。发病率高，病程短。该病主要侵害3-12周龄的雏鸡与青年鸡，破坏法氏囊的B淋巴细胞，导致不同程度的免疫抑制，并可诱发多种疫病或使多种疫苗免疫失败，从而使病鸡增加对并发和继发性病毒和细菌感染的易感性，是近几年来严重威胁我国养鸡业的重要传染病之一。目前，在IBD的防制中，主要使用传统活疫苗和灭活疫苗。传统的灭活疫苗经历了一个由弱毒疫苗向强毒疫苗、由单一毒株疫苗向多毒株疫苗发展的过程。采用中毒力或强毒力毒株研制疫苗尽管可以提高鸡体的IBD抗体滴度，但易损伤靶器官法氏囊组织导致免疫机能低下、免疫抑制，进而对其它疫病的易感性增高或对其它疫苗的免疫应答能力降低，易继发其它疫病；多毒株疫苗，从理论上忽略了Ⅰ型疫苗毒对同是Ⅰ型的超强毒及变异株的交叉保护作用，忽略了不同毒株同时在相同靶细胞中增殖时发生重组的可能性，忽略了由此产生的对生态安全的危害，疫苗的研发中应该避开这些误区。灭活疫苗多由鸡胚或细胞适应毒制备，成本较高，制约了它的使用。因此发展广谱、高效、实用的新型疫苗成为迫切需要。在新型疫苗的研究使用中，发现直接应用克隆表达的抗原蛋白作为疫苗的免疫保护效果还不理想。这是因为新型疫苗中的可溶性抗原往往免疫原性较弱，无法激起有效地粘膜免疫。解决这一问题最成功的策略是使用疫苗载体来运送抗原到达粘膜表面，而在疫苗载体中，沙门氏菌凭借自身的优势获得了广泛的研究和应用。但目前存在着缺少稳定的沙门氏菌弱毒株，不能稳定表达外源蛋白，从而引起有效的免疫反应等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种弱毒肠炎沙门氏菌，以及用该弱毒肠炎沙门氏菌作为宿主所构建的重组肠炎沙门氏菌弱毒株，可用于制备疫苗。本专利技术首先提供一种弱毒肠炎沙门氏菌(SalmonellaEnteritidis)rSD株，于2016年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏编号：CGMCCNO.13346。本专利技术所提供的弱毒肠炎沙门氏菌用于制备重组疫苗株；所述的重组疫苗株，是将外源的免疫抗原基因转入到上述的弱毒肠炎沙门氏菌中制备的；作为本专利技术实施例的优选，所述的免疫抗原基因为IBDV的VP2基因；本专利技术另一个方面提供一种重组肠炎沙门氏菌活载体疫苗株，其基因组中包含IBDV的VP2基因。上述的重组肠炎沙门氏菌活载体疫苗株命名为肠炎沙门氏菌(SalmonellaEnteritidis)△VP2(salmonella)株，于2016年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCCNO.13251。本专利技术提供的重组沙门氏菌活载体疫苗菌株可用于制备疫苗。本专利技术提供的弱毒肠炎沙门氏菌作为宿主所构建的重组疫苗株遗传稳定性好，在普通培养基连续传代20代，插入的外源基因没有发生任何突变；重组菌不含任何抗性，这符合现代细菌活疫苗的发展趋势，安全性好，不用考虑抗生素残留。重组菌生长繁殖性能良好，没有因为外源基因的插入而影响细菌的增殖。附图说明图1野生菌株SD株、弱毒菌株rSD株与重组菌株△VP2(salmonella)的生长曲线图。具体实施方式本专利技术筛选获得了肠炎沙门氏菌弱毒株，用该弱毒株来构建弱毒沙门氏菌疫苗株，构建的重组弱毒沙门氏菌疫苗株不仅毒力弱，安全性好，而且稳定，表达效率高，诱导产生的抗体可有效地提供免疫保护作用；从而促成了本专利技术。实施例1、肠炎沙门氏菌弱毒株的筛选申请人将从临床分离的疑似沙门氏菌进行生化试验、血清学试验和测序鉴定后，确定为肠炎沙门氏菌，命名为SD株。在经过传代筛选后获得了肠炎沙门氏菌重组菌株rSD株。通过生长曲线的测定发现基因缺失后没有影响细菌的生长速度，通过雏鸡攻毒试验等确定其为弱毒株。将rSD株作为母本菌株进行下一步的研究。本专利技术的弱毒肠炎沙门氏菌rSD株，于2016年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏编号：CGMCCNO.13346。实施例2、VP2基因转移载体的构建根据质粒pkD3中Cat基因的序列和克隆载体pBluescriptKS(+/-)的多克隆酶切位点，利用Primer5.0软件设计Cat基因的特异性引物：上游引物pKD3-IIP1:CACGGATCCgtgtaggctggagctgcttc加入了BamHI酶切位点；下游引物pKD3-IIP2:CAGGAATTCcatatgaatatcctccttag加入了EcoRI酶切位点。以质粒pkD3为模板进行PCR扩增，并用DNA纯化回收试剂盒回收目的基因。回收的目的基因片段与载体pBluescriptKS(+/-)一起进行双酶切反应，核酸电泳，用DNA纯化回收试剂盒回收目的基因后，用T4DNA连接酶进行连接获得重组质粒。将该重组质粒转入大肠杆菌JM109，测序鉴定，并命名为pBlu-pKD3。PCR扩增VP2基因，上游引物：VP2-P1：CAGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACCC加入了EcoRI酶切位点，下游引物：VP2-P2：GACAAGCTTTTACCTTATGGCCCGGAT加入了HindⅢ酶切位点。回收目的基因，与质粒pBlu-pKD3一起进行双酶切反应，1％琼脂糖凝胶电泳，用DNA纯化回收试剂盒回收目的基因后，用T4DNA连接酶进行连接获得重组质粒。将该重组质粒转入大肠杆菌JM109，测序鉴定，并命名为pBKV。实施例3、打靶片段的制备用于同源重组的引物由两部分组成，5'端大写的50nt的序列与靶基因两翼序列同源，3'端小写的20nt的序列与转移载体cat抗性基因或目的基因两侧序列同源。上游引物：VP2-D1：AGTGGACTAACAACATCGGTGATGCCAACACCATCGGCACCCGTCCGGACgtgtaggctggagctgcttc；下游引物：VP2-D2：CAGAGCAAAAAACCCCGCGACGCGGGGTTTTTTATCAGACGGAAACTTAAttaccttatggcccggat。以重组质粒pBKV为模板，PCR扩增打靶片段，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的条带，回收产物用DpnI消化处理。1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的条带，测定DNA浓度。实施例4、感受态细胞的制备将质粒pKD46转化至氯化钙法制备的弱毒沙门氏菌感受态中，于氨苄青霉素平板上30℃培养过夜，挑取单个菌落接种于含氨苄的LB培养基30℃震荡培养过夜。取400ul培养物接种10mL含Amp的LB培养基，220rpm振荡培养至OD600＝0.6，冰浴10min，4℃、4000rpm离心10min收集细菌，沉淀用冰浴预冷的10％甘油洗3遍，用40uL预冷的10％甘油重悬，即为感受态细胞。实施例5、电击转化及抗性基因的消除取2uL打靶片段(约100ng本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种弱毒肠炎沙门氏菌，其特征在于，所述的弱毒肠炎沙门氏菌的保藏编号为CGMCC NO.13346。

【技术特征摘要】
1.一种弱毒肠炎沙门氏菌，其特征在于，所述的弱毒肠炎沙门氏菌的保藏编号为CGMCCNO.13346。2.权利要求1所述的弱毒肠炎沙门氏菌在制备重组疫苗株中的应用。3.一种制备沙门氏菌重组疫苗株的方法，其特征在于，所述的方法是将外源的免疫抗原基因转入到权利要求1所述的弱毒肠炎沙门氏菌中。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的免疫抗原基因为IBDV...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明义，孙化露，刘阳，毕云英，李思菲，于泽坤，马丽，马礼照，单学强，颜瑞娟，胡秀香，李朝阳，
申请(专利权)人：山东信得科技股份有限公司，青岛信得药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37