一株能高效降解石油的地衣芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株能高效降解石油的地衣芽孢杆菌，该菌株名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Yb1，菌株已于2015年9月18日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.11427。本发明专利技术还公开了所述菌株在降解石油中的应用或在生物修复石油污染环境中的应用。实验显示：本发明专利技术的菌株可以将石油作为唯一碳源，降解石油，且降解率接近43％，预示其可用于石油污染的土壤或水体的治理，在消除石油污染方面具有较好的应用前景和经济价值。

【技术实现步骤摘要】
一株能高效降解石油的地衣芽孢杆菌及其应用
本专利技术涉及一株地衣芽孢杆菌及其应用，尤其涉及一株能高效降解石油的地衣芽孢杆菌及其在生物修复石油污染环境中的应用，属于生物

技术介绍
石油作为现代工业的血液，为人类文明的进步和发展做出了巨大贡献。然而石油在给人们带来巨大经济利益的同时，也对生态环境造成了巨大的威胁。在勘察、开采、运输以及储存过程中，石油所造成的土壤污染问题是一个长期存在的环境问题，石油污染使得土壤理化性质发生改变，不利于农作物生长；石油烃中不易被土壤吸附的部分会逐渐渗入到地下，进一步污染地下水源。因此治理石油所造成的土壤污染具有十分重要的现实意义，针对石油污染土壤的修复研究也是目前环境保护领域中的研究热点(2003年，Hamme等)。目前土壤中石油污染的处理方法按其性质可分为3种：物理方法，化学方法和生物方法。物理方法包括挖掘填埋法、气提吹脱法、电解法、洗涤法和隔离控制法等；化学方法包括氧化剂氧化法、光化学氧化法、热分解法、萃取法等等。以前使用的主要是这两类方法，虽可产生一定的实效，但是处理费用昂贵而且容易造成严重的二次污染。相较而言，生物方法具有物理方法和化学方法不可比拟的优势，首先是处理费用低，其处理成本大约只有物化方法的三分之一；其次是修复操作简单，可以原位进行修复(2011年，Mukherjee和Bordoloi)；再次生物法修复对环境的二次污染较小(2002年，Ron和Rosenberg)。石油烃降解菌是能将石油烃作为唯一碳源进行生物降解，并产生气体、脂肪酸及生物表面活性剂等代谢产物的一类微生物的总称。石油烃降解菌在石油污染环境的生物修复中有着重要的作用，在微生物采油研究领域的应用日趋广泛(1997年，何良菊等)。由于自然界中的微生物具备资源丰富、易于培养和对环境的耐受性较强等诸多优点，对于生物修复石油污染环境具有广阔的应用前景。但检索发现目前有关能高效降解石油的地衣芽孢杆菌及其在生物修复石油污染环境中的应用还鲜见报道。参考文献1.HammeJ.D.V.,SinghA.,WardO.P.MicrobiolMolBiolRev,2003,67(4):503-549.2.MukherjeeA.K.,BordoloiN.K.Environ.Sci.Pollut.Res.Int,2011,471:478.3.RonE.Z.,RosenbergE.Curr.Opin.Biotechnol,2002,249:252.4.何良菊，魏德洲，张维庆.环境科学进展,1997,7(3):110-115.
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术要解决问题是提供一株能高效降解石油的地衣芽孢杆菌及其在修复石油污染环境中的应用。本专利技术所述能高效降解石油的地衣芽孢杆菌，其特征在于：该菌株名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)Yb1，菌株已于2015年9月18日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCNo.11427。上述的能高效降解石油的地衣芽孢杆菌，其生物学特征是：呈现杆状，单个，细胞大小为(0.6μm～0.8μm)×(1.3μm～2.0μm)，20-24小时开始生孢子，37℃固体培养时菌落初期呈椭圆形，随着培养时间的延长逐渐呈不规则状，菌落扁平且不透明、表面粗糙、边缘不齐；其生理生化特征是：革兰氏染色阳性，兼性厌氧，化能异养菌，最适生长温度为30～37℃，最适合生长pH值为6.5～7.5，生理生化实验结果与地衣芽孢杆菌模式菌株相比一致，详见表1。表1：Yb1菌株与Bacilluslicheniformis的生理生化特征比较注：“+”表示菌株阳性；“-”表示菌株阴性。*：东秀珠蔡妙英等，常见细菌系统鉴定手册，科学出版社，2001，第一版，p62-63上述用于菌体形态观察的液体培养基组成是：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，并调节pH7.5。上述用于菌体形态观察的固体培养基组成是：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，琼脂粉15g，并调节pH7.5。上述形态特征观测的实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p353-363。上述生理生化试验培养基及实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p364-398。实验证实：本专利技术所述的Yb1菌株在以石油为唯一碳源的无机盐固体培养基上培养时能够降解石油，同时产生明显的降解圈，结果见图3。测定显示该菌株对石油的降解率接近43％。预示其在治理石油污染土壤或水体方面具有较好的应用前景。对本专利技术所述菌株Yb1测定16SrRNA基因序列的结果显示，其基因序列长度为1419bp，该核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。通过使用美国生物工程信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)BLASTN程序比对，发现本专利技术的Yb1菌株16SrRNA的基因序列与NCBI注册的多株地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)16SrRNA的基因序列具有高度同源性，可以确定本专利技术所述Yb1菌株是一株地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。选取同源性比较高的典型地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的16SrDNA序列作为参比对象；采用邻近法(Neighbour-Joining)运用Mega5软件构建Yb1菌株与参比菌株之间的系统进化树，选用Pseudomonasaeruginosa作为外群分支。结果见附图4。本专利技术所述的能降解石油的地衣芽孢杆菌Yb1菌种选育的基本方法是：将采集到的石油污染的土壤样品用无菌生理盐水溶解，振荡混匀制成土壤悬液，梯度稀释涂布平板，37℃条件下静置培养，至有明显的石油降解圈出现，挑取石油降解圈较大的菌落，划线转接到固体培养基，37℃条件下静置培养，至有明显的单菌落产生，经两次纯化后，甘油冻藏保菌。该菌株已于2015年9月18日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCNo.11427。本专利技术所述能高效降解石油的地衣芽孢杆菌在降解石油中的应用或在生物修复石油污染环境中的应用。其中：所述石油污染环境优选是指石油污染的土壤或石油污染的水。具体的，上述应用涉及的方法是：(1)菌种选择：选地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)Yb1菌株；(2)斜面培养活化菌种：将菌种接种于斜面培养基，35～40℃条件下，静止培养20～40小时，备用；(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株在无菌条件下用接种环接1～2环于含有50mL液体种子培养基的三角瓶(250mL)中，置旋转转速为180～220转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，35～40℃培养18～24小时，得种子液；(4)生物修复石油污染环境及石油分解率检测：以1～5％的体积比的接种量，将种子液接种于模拟石油污染环境的含有50mL已添加100mg原油的无机盐培养基的三角瓶(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株能高效降解石油的地衣芽孢杆菌，其特征在于：该菌株名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Yb1，菌株已于2015年9月18日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.11427。

【技术特征摘要】
1.一株能高效降解石油的地衣芽孢杆菌，其特征在于：该菌株名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)Yb1，菌株已于2015年9月18日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCNo.11427。2.权利要求1所述能高效降解石油的地衣芽孢杆菌在降解石油中的应用或在生物修复石油污染环境中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述石油污染环境是指石油污染的土壤或石油污染的水。4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述应用涉及的方法是：(1)菌种选择：选地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)Yb1菌株；(2)斜面培养活化菌种：将菌种接种于斜面培养基，35～40℃条件下，静止培养20～40小时，备用；(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株在无菌条件下用接种环接1～2环于含有50mL液体种子培养基的三角瓶中，置旋转转速为180～220转/分钟、旋转半径为40mm的摇床上，35～40℃培养18～24小时，得种子液；(4)生物修复石油污染环境及石油分解率检测：以1～5％的体积比的接种量，将种子液接种于模拟石油污染环境的含有50mL已添加100mg原油的无机盐培养基的三角瓶...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡玮，王静，王川东，胡翠，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37