经修饰的TNFα分子和编码该TNFα分子的DNA以及含有该TNFα分子和该DNA的疫苗制造技术

本发明专利技术涉及一种经修饰的人ＴＮＦα分子，将所述经修饰的ＴＮＦα分子接种人类宿主后，能诱发针对野生型人ＴＮＦα的中和抗体，此分子中人ＴＮＦα分子的至少一个肽片段被至少一个已知含有免疫显性Ｔ细胞抗原决定部位的肽或含有免疫显性抗原决定部位和包含至少一个ＴＮＦαＢ细胞抗原决定部位的人ＴＮＦα分子的一或两侧外侧区域的所述分子的截断形式所取代，其中取代作用造成前β－折叠、任一连接环和／或后β－折叠的Ｂ’、Ｉ或Ｄ股的任一股氨基酸序列的实质改变。经修饰人ＴＮＦα分子或其编码ＤＮＡ可以选择性地与药学上可接受的佐剂一起配制成对抗ＴＮＦα的疫苗用于预防或治疗慢性炎症疾病如类风湿性关节炎与炎性肠症、癌症、多发性硬化症、糖尿病、牛皮癣、骨质疏松症或哮喘。通过与含有该经修饰ＴＮＦα的组合物接触，测试人体液中ＴＮＦα的存在。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及经过修饰的人细胞因子肿瘤坏死因子α(TNFα)分子，所以将此经修饰TNFα分子施加至人类宿主能够诱发对抗野生型人TNFα的中和抗体。本专利技术也涉及根据该经修饰TNFα分子的人TNFα疫苗。本专利技术其它方面将揭示于下文讨论中。专利技术背景生理学上而言，脊椎动物的免疫系统是作为防止感染物如微生物，侵害身体的防御机制。外来蛋白借助于高特异性的循环抗体通过网状内皮系统予以有效清除，病毒与细菌则由细胞性与体液性机制组成的复合式屏障予以攻击，该机制包括抗体、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、天然杀伤细胞(NK)、补体等等。领导此种抗战的是T辅助(TH)淋巴细胞，它与抗原呈递细胞(APC)共同通过细胞因子的复合网络调节免疫对抗作用。TH淋巴细胞可识别呈现在APC表面的蛋白抗原。但不识别天然抗原本身。相反，它显然可识别由两种成分组成的复合配体，该成分是“经处理”(片段化)的蛋白抗原(所谓的T细胞抗原决定部位)与主要组织相容性复合体II类分子(O.Werdelin等，Imm，Rev.106，181(1988))。此识别作用最后造成TH淋巴细胞专一地辅助B淋巴细胞产生对抗完整蛋白抗原的特异抗体(Werdelin等，如上)。某特定T细胞仅识别一些抗原-MHC组合，但不识别由另一个MHC等位基因的基因产物所呈递的上述相同抗原或另一抗原。此现象为MHC限制性。自体蛋白的片段也会由APC呈递，但这些片段一般被T辅助淋巴细胞忽略或不被识别。这是个体为何通常不会有自身抗体存在其血清中，最后致使攻击该个体的自身蛋白(所谓自体蛋白或自身蛋白)的主要理由。但有极少数例子，此过程失误，免疫系统变成对抗个体的自身组份，如此导致自身免疫疾病。某些自体蛋白在其量升高会导致病症的情况下，此自体蛋白的出现是不当的。已知肿瘤坏死因子α(TNFα)能够引起癌症病人及患有其它慢性疾病的病人中的恶病质(H.N.Langstein等，癌症研究51.2302-2306，1991)。TNFα也在炎症过程中起重要作用(W.P.Arend等，Arthritis Rhem.33，305-315，1990)，且利用单克隆抗体中和TNFα已证实对患慢性炎症疾病例如类风湿性关节炎有效(Elliott等，Lancet 1994，3441105-10)及空氏症(Crohn’s)的病人有效(VanDullemen等，肠胃病学109(1)129-135(1995))。因此需要一种用于诱发对抗这种TNFα蛋白的中和抗体的方法，而本专利技术包括提供此特性的对抗TNFα的疫苗。肿瘤坏死因子1.总论肿瘤坏死因子(TNF)是调节蛋白细胞因子家族的一员(参见Walsh，G和Headon，D.E.，蛋白生物技术，1994，John Wiley & Sons Ltd.，England，第257-267页)，该家族也包括干扰素与白细胞介素。目前已知TNF有两型，分别为TNFα与TNFβ。虽然这两种蛋白皆与相同受体结合并诱发广效的相似生物学反应，但它们是不同分子且同源性不到30％。命名为肿瘤坏死因子的原始蛋白是以TNF表示，命名为TNFα更恰当，它也以恶病质素(cachectin)而为人所知。TNFβ也可表示淋巴毒素(lymphotoxin)。TNFα是由多种细胞制造，最著名的是经活化的巨噬细胞、单核细胞、某些T淋巴细胞与NK细胞，以及脑细胞和肝细胞。诱发TNFα合成的最强诱导物是一种，称为脂多糖的复合生物分子(LPS)。它含有脂质与多糖两种组份，也可称为内毒素。脂多糖本身不具有任何抗肿瘤活性。注射脂多糖的动物血清中发现含有对癌细胞有毒性的因子，此因子由对脂多糖产生反应的特定细胞产生，命名为肿瘤坏死因子。诸如某些病毒、真菌及寄生虫等多种其它因素也可刺激此细胞因子的合成与释放。此外，TNFα分子也可以自分泌方式，刺激其本身的产生。天然人类TNFα是同三聚体，由绕着左右对称的三重轴而紧密结合的三个相同的多肽亚单位组成，下文将进一步说明。这种排列方式类似许多病毒衣壳蛋白亚单位的组装。人TNFα的个体多肽亚单位是非糖基化的，由157个氨基酸组成。此分子的分子量为17300Da，仅含一个链内二硫键。人TNFα最初是合成233个氨基酸前体分子。包括信号序列-76至-1前序列的蛋白酶剪切，释放出了天然TNFα。TNFα也可以26000Da的膜结合型式存在。三个TNFα单体亚单位非共价结合而形成三聚体，下文进一步说明。TNFα通过结合易感细胞表面的特异受体而诱发其生物作用。已鉴定出两种不同的TNFα受体。其中一个受体(TNF-R55)的分子量为55000Da，而第二受体(TNF-R75)的分子量约为75000Da。此两种不同受体类型的序列同源性不超过25％。TNF-R55出现在多种细胞上，但TNF-R75的分布较局限。两者都是穿膜糖蛋白，具细胞外结合结构域，疏水性跨膜结构域及细胞内效应结构域。TNFα诱发生物作用的确实分子机制仍有待确定。TNFα结合至其受体似乎起动了多种G-蛋白调节的反应，并活化了腺苷酸环化酶、磷脂酶A2及蛋白激酶。由TNFα诱生的确实生物作用随细胞种类改变。诸如额外细胞因子等其它因子的存在，进一步调节TNFα作用在敏感细胞所造成的观察到的分子效应。已克隆出TNFα基因且插入多种，细菌及真核细胞重组表达系统。所生成的经纯化且具生物活性的大量TNFα可利用性有助于临床评估多种疾病，尤其是癌症。已完成单独使用TNFα或与干扰素合并使用的多种试验，但结果令人十分失望。大量的TNFα不能施加至病人，因为其有毒性，即使不致死，也有副作用。如上所述，持续产生不当升高量的TNFα也会发展恶病质，耗废综合征通常与慢性寄生虫或其它感染症及癌症有关。TNFα也涉及某些癌症的转移与生长，以及诱发贫血。再者，TNFα也直接涉及某些人类慢性炎症失调症的发展，包括类风湿性关节炎及空氏症，这些病症已知施加抗-TNFα单克隆抗体是有效的。TNFα也涉及骨质疏松症与牛皮癣。此外，动物模型已显示，施加抗-TNFα抗体可减轻或预防移植或转植组织的排斥。2.TNFα的结构I.简介人肿瘤坏死因子(TNFα)的三维结构早已解决(参见“肿瘤坏死因子、结构、功能和作用机制”，Bharat B.Aggarwal和Jan Vilcek编辑，1992 Marcel Dekker公司，New York，第五章“TNFα的晶体结构”，Jones，E.Y.、Stuant，D.I.和Walker N.P.C合著)。TNFα的生物活性由其与其受体间的相互作用决定。此种相互作用由正确折叠的三级结构的精确组合所控制。所以如果想了解TNFα分子如何在氨基酸相互作用的层次上行使其生物学功能，不仅必须知道其氨基酸序列，也要知道其三维结构。II.三维结构借助于分析超离心、小角度x-射线离散法和凝胶电泳，得知具生物活性的TNFα在水溶液中是三聚体构象，交联研究显示此构象是该蛋白的活性形式(Smith和Baglioni，1987，生物化学杂志252，6951-6954)。结合分析法显示，此三聚体比单体的活性至少高出8倍。实验证据显示天然与重组TNFα在生理条件下都以三聚体为主要存在形式。圆二色谱的分析将TNFα归类为全部是折叠等级的蛋白(Davi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经修饰的人ＴＮＦα分子，将所述经修饰的ＴＮＦα分子接种人类宿主后，能诱发针对野生型人ＴＮＦα的中和抗体，此分子中人ＴＮＦα分子的至少一个肽片段被至少一个已知含有免疫显性Ｔ细胞抗原决定部位的肽或含有免疫显性抗原决定部位和包含至少一个ＴＮＦα Ｂ细胞抗原决定部位的人ＴＮＦα分子的一或两侧外侧区域的所述分子的截断形式所取代，其中取代作用造成前β－折叠、任一连接环和／或后β－折叠的Ｂ’、Ｉ或Ｄ股的任一股氨基酸序列的实质改变。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：MR詹森，S莫里生，H艾尔斯纳，I达鲁姆，
申请(专利权)人：法默卡有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]