一种用于活性污泥中产PHA假单胞菌初步研究的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于活性污泥中产PHA假单胞菌初步研究的方法：以富含混合菌群的活性污泥为原料，在筛选培养基上培养并结合尼罗蓝染色法筛选出PHA合成菌株；并通过菌种分离纯化以及菌种鉴定的方法，鉴定并获取其中的假单胞菌；对获取的假单胞菌进行碳源利用测试以及菌株的初步强化。通过进行假单胞菌在不同单一碳源培养基中的培养测试，以及菌浓度的测量与比较，可以判定OD

【技术实现步骤摘要】
一种用于活性污泥中产PHA假单胞菌初步研究的方法
本专利技术涉及一种用于活性污泥中产PHA假单胞菌初步研究的方法。技术背景聚羟基烷酸酯(PHA)由于其良好的生物相容性、环境友好性、原料可再生性等特点，可作为传统塑料的优良替代品而受到广泛关注[1]，且在生物医药领域也有广泛应用。从2011年至2020年，全球对PHA的需求量将从3万吨增长至12万吨以上[2,3]。从1926年PHB的发现，到现在已经过去整整80年了。在这80年里，文献报导了超过300种PHA生产菌，其中较为常见的有：重组大肠杆菌[4](RecombinantE.coli)，假单胞菌[5](Pseudomonassp.)，产碱杆菌[6](Alcaligeneseutrophus)，博克霍尔德式菌[7](Burkholderiacepacia)以及巨大芽孢杆菌[8](Bacillussp.)等。其中假单胞菌(Pseudomonas.sp)属于假单胞菌属，是一种革兰氏阴性菌，无核，严格好氧，假单胞菌在自然界中分布非常广泛，在土壤，水体，以及各种植物中均有分布。常见的几种假单胞菌，有铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)以及荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)等。常用于MCL-PHAs的生产，在加入C4～C6的糖类或者脂肪酸盐作为底物时，其胞内会积累大量的P(3HB-co-3HHx)以及P(3HB-co-3HD)等PHA共聚体，同时随着底物碳原子数量的不同，其积累的PHA共聚体的组成也不尽相同[9]。假单胞菌能利用的碳源很多，并且很多碳源都能用于PHA生产。Ward等人[10]利用苯乙烯、苯乙酸以及葡萄糖等作为底物，最终PHA的积累量达到了0.22gPHA/gCarbon。He等人[11]利用葡萄糖和大豆油作为底物，最终PHA积累量分别为52％和63％。另外，诸如木糖、果糖等常见碳源，也有文献报导其在假单胞菌积累PHA方面的应用。由于假单胞菌积累PHA的能力，其在微生物发酵生产PHA的研究中具有良好的开发前景，那么，对野生假单胞菌产PHA相关内容的初步研究以指导菌株的进一步优化就很有意义。[1]LeeSY.Decipheringbioplasticproduction.NatureBiotechnology,2006,24(10):1227-1229[2]LaraD,MichaelC,AchimR,etal.Marketdevelopmentsofandopportunitiesforbiobasedproductsandchemicals.Nova-InstituteforEcologyandInnovationReprot,2013,52202[3]SudeshK,BhubalanK,ChuahJA,etal.Synthesisofpolyhydroxyalkanoatefrompalmoilandsomenewapplications.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2011,89(5):1373-1386[4]S.Y.Lee.Poly(3-Hydroxybutyrate)ProductionfromXylosebyRecombinantEscherichiaColi.bioprocessengineering,1998,18(5):397-399[4]LeeSY.Poly(3-Hydroxybutyrate)ProductionfromXylosebyRecombinantEscherichiaColi.bioprocessengineering,1998,18(5):397-399[5]YoungFK,KastnerJR.,MaySW.MicrobialProductionofPoly-Β-HydroxybutyricAcidfromD-XyloseandLactosebyPseudomonasCepacia.ApplEnvironMicrobiol,1994,11:4195-4198[6]LinkoS,VaheriH,J.ProductionofPoly-Β-HydroxybutyratebyAlcaligenesEutrophusonDifferentCarbonSources.ApplMicrobiolBiotechnol,1993,39(1):11-15[7]KeenanTM,TanenbaumSW,StipanovicAJ,etal.ProductionandCharacterizationofPoly-Β-HydroxyalkanoateCopolymersfromBurkholderiaCepaciaUtilizingXyloseandLevulinicAcid.BiotechnologyProgress,2004,20(6):1697–1704[8]LemoigneM.ProductsofDehydrationandofPolymerizationofΒ-HydroxybutyricAcid.Bull.Soc.Chem.Biol,1926,8:770-782[9]TripathiL,WuLP,DechuanM,etal.PseudomonasPutidaKt2442asaPlatformfortheBiosynthesisofPolyhydroxyalkanoateswithAdjustableMonomerContentsandCompositions.BioresourTechnol,2013,142:225-231[10]WardPG,RooGD,O'ConnorKE.AccumulationofPolyhydroxyalkanoatefromStyreneandPhenylaceticAcidbyPseudomonasPutidaCa-3.ApplEnvironMicrobiol,2005,71(4):2046-2052[11]HeW,TianW,ZhangG,etal.ProductionofNovelPolyhydroxyalkanoatesbyPseudomonasStutzeri1317fromGlucoseandSoybeanOil.FEMSMicrobiolLett,1998,169(1):45-49
技术实现思路
鉴于上述，本专利技术提出一种用于合成PHA野生假单胞菌初步研究的方法，即积累PHA所需最优单一碳源的判定以及菌种初步强化方法。本专利技术的技术方案如下：一种用于活性污泥中产PHA假单胞菌初步研究的方法：以富含混合菌群的活性污泥为原料，在筛选培养基上培养并结合尼罗蓝染色法筛选出PHA合成菌株；并通过菌种分离纯化以及菌种鉴定的方法，鉴定并获取其中的假单胞菌；对获取的假单胞菌进行碳源利用测试以及菌株的初步强化。具体步骤如下：(1)取活性污泥样品，接种于筛选培养基中，培养36h后，取菌液稀释至10-4-10-6倍并涂布在固体培养基上，将长出的单菌落进行尼罗蓝染色，并挑选出能被尼罗蓝染色的单菌落；对获取的假单胞菌进行碳源利用测试以及菌株的初步强化。(2)利用细菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于活性污泥中产PHA假单胞菌初步研究的方法，其特征是：以富含混合菌群的活性污泥为原料，在筛选培养基上培养并结合尼罗蓝染色法筛选出PHA合成菌株；并通过菌种分离纯化以及菌种鉴定的方法，鉴定并获取其中的假单胞菌；对获取的假单胞菌进行碳源利用测试以及菌株的初步强化。

【技术特征摘要】
1.一种用于活性污泥中产PHA假单胞菌初步研究的方法，其特征是：以富含混合菌群的活性污泥为原料，在筛选培养基上培养并结合尼罗蓝染色法筛选出PHA合成菌株；并通过菌种分离纯化以及菌种鉴定的方法，鉴定并获取其中的假单胞菌；对获取的假单胞菌进行碳源利用测试以及菌株的初步强化。2.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤如下：(1)取活性污泥样品，接种于筛选培养基中，培养36h后，取菌液稀释至10-4-10-6倍并涂布在固体培养基上，将长出的单菌落进行尼罗蓝染色，并挑选出能被尼罗蓝染色的单菌落；对获取的假单胞菌进行碳源利用测试以及菌株的初步强化。(2)利用细菌基因组提取试剂盒提取筛选得到的细菌的基因组，然后对基因组16SrDNA进行扩增，将得到的PCR产物测序，根据测序结果以及GenBank数据库对比分析，确定菌株。3.如权利要求2所述的方法，其特征是筛选培养基为：蛋白胨10，牛肉膏5，葡萄糖5，硫酸铵0.5，硫酸镁0.05，磷酸二氢钾0.1，pH调整为7；采用蒸馏水配置，并在灭菌锅中115℃灭菌30min，其中葡萄糖单独灭菌，两部分分别灭菌后，再于无菌条件下混合。4.如权利要求2所述的方法，其特征是所述的碳源利用测试过程包括分别选取葡萄糖、木糖、乙酸钠、蔗糖、乳酸钠和柠檬酸的常见碳源作为单...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾晓强，杨松源，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12