一种灰霉病菌菌种的长期保存方法技术

本发明专利技术公开了一种灰霉病菌菌种的长期保存方法，利用灰霉病菌分生孢子能在水中长时期保持活力的生存特性，采用灰霉病菌分生孢子作为菌种的存贮菌体，长期保存灰霉病菌菌种，长期保存方法的步骤如下：1.分生孢子的制备培养；2.分生孢子的净化；3.灰霉病菌菌种的存贮；4.灰霉病菌菌种复活培养。本发明专利技术的优点是：1)菌种存活期超过2年，保存时间长；不需要每年转管培养的菌种护理工作，也减小菌种变异机率。2)用可密封的管具装盛菌种，保存期间污染机率小，而且管具体积小，贮存菌种需要空间少，便于管理。

【技术实现步骤摘要】
一种灰霉病菌菌种的长期保存方法
本专利技术涉及植物病理学技术。具体是一种灰霉病菌菌种的长期保存方法。
技术介绍
作物灰霉病是葡萄、番茄、黄瓜等作物的重要病害，发病严重时可给生产造成重大经济损失。该类病害均由灰霉病菌(Botrytiscinerea)侵染造成。科学有效地防治作物灰霉病，有赖于该类病害的基础研究，而该类病害病原菌菌种的有效保存则是许多基础研究的基础工作。在一般实验室中，灰霉病菌菌种的保存往往采用试管斜面培养基生长的菌丝体形态保存，这样的保存方法虽然简单有效，但也存在一些弊病，主要是保存时间较短；要达到长期保存菌种的目的，每年需要1～2次的转管培养护理工作，在菌株数量较多时，护理工作量大，耗时费力；另外，反复的转管培养会增加菌种的污染和变异机率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种灰霉病菌菌种的长期保存方法。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种灰霉病菌菌种的长期保存方法，是利用灰霉病菌分生孢子能在水中长时期保持活力的生存特性，采用灰霉病菌分生孢子作为菌种的存贮菌体，长期保存灰霉病菌菌种，长期保存方法的步骤如下：1.分生孢子的制备培养采用普通三角瓶作制备培养分生孢子的器具；以马铃薯葡萄糖培养基作产孢培养基，该培养基的配比为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL；将灰霉病菌的菌丝体移植入三角瓶装的培养基面上；在适合的温度下培养，直至菌落上形成茂密的菌丝及分生孢子。2.分生孢子的净化用无菌水洗涤步骤1培养获得菌落，得到初步的分生孢子液；通过纱布过滤处理去除该初孢子液中的菌丝碎段；再通过离心沉淀处理，去除该孢子液中的培养基组分及菌体代谢物，获得的离心沉淀物是较为纯净的分生孢子，以该纯净的分生孢子作为菌种保存的菌体形态；3.灰霉病菌菌种的存贮用无菌水将步骤2的分生孢子沉淀重新悬浮，搅动悬浮液使分生孢子充分分散，再用无菌水将该孢子悬浮液适当稀释，以该孢子液作为灰霉病菌菌种的保存液；将该孢子液分装入灭菌的冷冻管中，并转移到20℃环境下存放。4.灰霉病菌菌种复活培养取出步骤3贮存菌种保存液的冷冻管，充分振荡使分生孢子悬浮并分散均匀，用微量移液器取少量分生孢子液转移到常用培养基上，在合适温度下培养，分生孢子恢复萌发生长，并形成生活态的菌丝体菌落。本专利技术的优点是：1.菌种存活期超过2年，保存时间长。2.不需要每年转管培养的菌种护理工作，也减小菌种变异机率。3.用可密封的管具装盛菌种，保存期间污染机率小，而且管具体积小，贮存菌种需要空间少，便于管理。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步描述。长期以来，灰霉病菌的菌种保存方法，均为使用该病菌的菌丝体进行菌种保存。专利技术人发现灰霉病菌的分生孢子能在水介质中暂停生长，但长时期保持生活力，该生存特性对改进灰霉病菌菌种保存技术非常有利；本专利技术的关键技术，就是利用灰霉病菌的分生孢子进行菌种保存。本专利技术技术的重要环节是需要制备没有污染的单纯的灰霉病菌分生孢子。当前培养制备灰霉病菌分生孢子的常规方法是用培养皿平板培养方法培养获得孢子。培养皿的通气性良好，有利于灰霉病菌菌落产孢，但培养皿的良好通气性恰好容易造成环境污染菌的污染。专利技术人发现灰霉病菌在较为封闭的三角瓶内也能正常产生孢子，而三角瓶预防污染的功效非常好，因而本专利技术采用三角瓶作培养器具，制备培养灰霉病菌的分生孢子。灰霉病菌在多种常规培养基上都能产孢，本专利技术采用马铃薯葡萄糖培养基(PDA)，该培养基配比为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL；灰霉病菌在该培养基上，在23℃温度条件下通常培养7～9天，能在培养基面上形成茂密的菌丝体和大量的分生孢子。用无菌水洗涤收集分生孢子操作过程中，通常需要用T形玻棒等工具轻轻抹刷菌落，因此，洗涤出的孢子液一般含有较多的菌丝碎段以及溶出一些培养基组分和菌体外泌物；通过纱布过滤和离心处理能去除这些不需要的杂物，获得较为纯净的分生孢子；将这纯净的分生孢子存放于无菌水中进行菌种保存。作菌种保存的分生孢子液，其孢子浓度无需严格定量，本专利技术保存的菌种，孢子液的浓度调配为106孢子/mL。可在一般室内环境温度下存放，本专利技术发现在20℃环境下存放效果好。需要复活使用菌种时，无菌条件下，用移液器吸取少量孢子液移植到常规培养基上，合适温度下培养2天后，可获得具正常活力的菌丝体新菌落。用本专利技术方法保存菌种2年后，取样进行活力测试，移植3～5μL菌种孢子液到培养基上，都能长出新的菌落。实施例1应用本专利技术一种灰霉病菌菌种的长期保存方法，以分生孢子作为菌种的存贮菌体，保存灰霉病菌菌株Bc-1菌种，按如下步骤操作实施：1.分生孢子的制备培养采用普通三角瓶作制备培养分生孢子的器具；以马铃薯葡萄糖培养基作产孢培养基，该培养基的配比为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL；将灰霉病菌菌株Bc-1的菌丝体移植入三角瓶装的培养基面上；在23℃的温度下培养7天，菌落上形成茂密的菌丝及分生孢子。2.分生孢子的净化用无菌水洗涤步骤1培养获得菌落，得到初步的分生孢子液；通过纱布过滤处理去除该初孢子液中的菌丝碎段；再通过离心沉淀处理，去除该孢子液中的培养基组分及菌体代谢物，获得的离心沉淀物是较为纯净的分生孢子，以该纯净的分生孢子作为菌种保存的菌体形态。3.灰霉病菌菌种的存贮用无菌水将步骤2的分生孢子沉淀重新悬浮，搅动悬浮液使分生孢子充分分散，再用无菌水将该孢子悬浮液稀释成106孢子/mL的孢子液，以该孢子液作为菌株Bc-1菌种的保存液；将该孢子液分装入灭菌的5mL冷冻管中，并转移到20℃环境下存放。4.灰霉病菌菌种复活培养取出步骤3存放了2年的菌株Bc-1菌种液的冷冻管，充分振荡使分生孢子悬浮并分散均匀，用移液器取3μl分生孢子液移植到马铃薯葡萄糖培养基上，在23℃温度下培养2天后，每个移植点都生长形成新的菌丝体菌落。实施例2应用本专利技术一种灰霉病菌菌种的长期保存方法，以分生孢子作为菌种的存贮菌体，保存灰霉病菌菌株Bc-2菌种，按实施例1的步骤1至步骤4操作实施，不同的只是步骤1、步骤3和步骤4的菌株是Bc-2。同样用移液器取出存放了2年的分生孢子液3μl移植到马铃薯葡萄糖培养基上，23℃温度下培养2天后，每个移植点都生长形成新的菌丝体菌落。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种灰霉病菌菌种的长期保存方法，其特征在于，利用灰霉病菌分生孢子能在水中长时期保持活力的生存特性，采用灰霉病菌分生孢子作为菌种的存贮菌体，长期保存灰霉病菌菌种；长期保存方法的步骤如下：1)分生孢子的制备培养：采用普通三角瓶作制备培养分生孢子的器具；以马铃薯葡萄糖培养基作产孢培养基，该培养基的配比为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL；将灰霉病菌的菌丝体移植入三角瓶装的培养基面上；在适合的温度下培养，直至菌落上形成茂密的菌丝及分生孢子；2)分生孢子的净化：用无菌水洗涤步骤1)培养获得菌落，得到初步的分生孢子液；通过纱布过滤处理去除该初孢子液中的菌丝碎段；再通过离心沉淀处理，去除该孢子液中的培养基组分及菌体代谢物，获得的离心沉淀物是较为纯净的分生孢子，以该纯净的分生孢子作为菌种保存的菌体形态；3)灰霉病菌菌种的存贮：用无菌水将步骤2)的分生孢子沉淀重新悬浮，搅动悬浮液使分生孢子充分分散，再用无菌水将该孢子悬浮液适当稀释，以该孢子液作为灰霉病菌菌种的保存液；将该孢子液分装入灭菌的冷冻管中，并转移到20℃环境下存放；4)灰霉病菌菌种复活培养：取出步骤3)贮存菌种保存液的冷冻管，充分振荡使分生孢子悬浮并分散均匀，用微量移液器取少量分生孢子液转移到常用培养基上，在合适温度下培养，分生孢子恢复萌发生长，并形成生活态的菌丝体菌落。...

【技术特征摘要】
1.一种灰霉病菌菌种的长期保存方法，其特征在于，利用灰霉病菌分生孢子能在水中长时期保持活力的生存特性，采用灰霉病菌分生孢子作为菌种的存贮菌体，长期保存灰霉病菌菌种；长期保存方法的步骤如下：1)分生孢子的制备培养：采用普通三角瓶作制备培养分生孢子的器具；以马铃薯葡萄糖培养基作产孢培养基，该培养基的配比为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL；将灰霉病菌的菌丝体移植入三角瓶装的培养基面上；在适合的温度下培养，直至菌落上形成茂密的菌丝及分生孢子；2)分生孢子的净化：用无菌水洗涤步骤1)培养获得菌落，得到初步的分生孢子液；通过纱布过滤处理去除该初孢子液中的菌丝...

【专利技术属性】
技术研发人员：王忠文，张君成，曾东强，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45