一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株，所述的CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株为LZ△CDPK2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201655；并提供了其制备方法。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术提供的一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株及其制备方法，是建立在分子生物学基础上，基于CRISPR/Cas9基因敲除技术，构建的基因缺失虫株，虫株具有不形成包囊的生物学特性，是具有巨大应用价值的虫株，可作为减毒活疫苗的候选虫株。

【技术实现步骤摘要】
一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株及其制备方法
本专利技术涉及弓形虫弱毒虫株
，具体涉及一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株及其制备方法。
技术介绍
弓形虫病（Toxoplasmosis）是由弓形虫引起的一种人兽共患寄生虫病。全球约有三分之一的人口受其感染，弓形虫可以感染几乎所有的温血动物、传染性强、流行范围大、宿主谱广，目前尚无疫苗可用，因而防治该病的难度极大，对防治技术的要求很高。鉴于药物治疗弓形虫病能力有限且毒副作用大的特点，研制其疫苗已逐渐成为防控弓形虫病势在必行的重大任务。目前，抗弓形虫疫苗的类型主要包括全虫（灭）活疫苗、虫体特异组分疫苗、亚单位疫苗、病毒等活载体疫苗和蛋白及核酸疫苗等，然而大多数疫苗均不是很理想，为了增强免疫效果，提高免疫保护率，减毒活疫苗的疫苗研制将成为一个重要的研究课题。在弓形虫中，Ca2+浓度的变化调控着下游的效应分子，影响着寄生虫入侵、外出宿主细胞、在宿主体内移行等多个重要过程。钙依赖蛋白激酶（Calcium-dependentproteinkinases，CDPKs）就是接收并传导这种Ca2+信号的效应分子之一。CDPKs是一种丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，活性直接受Ca2+的调控而不依赖于钙调素（CaMs）和磷脂弓形虫是较病毒和细菌更为高等的生物。在弓形虫中发现的CDPKs调控虫体入侵细胞、蛋白分泌、运动和分化等许多生理反应。现已证实的弓形虫CDPKs家族成员有13个，不同的家族成员具有不同的生物学功能，研究的较为透彻的是CDPK1、CDPK3、CDPK7等他们在黏附和入侵宿主细胞的功能、弓形虫在宿主体内移行以及弓形虫入侵宿主细胞后其在胞内的分裂增殖等方面具有重要的作用。因此构建CDPK家族基因缺失的弓形虫虫株将有望筛选到具有潜在应用价值的减毒活疫苗虫株。目前国际上仅有的能上市的弓形虫减毒活疫苗是S48，但是它仅限于对山羊和绵羊的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株及其制备方法。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株，所述的CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株为LZ△CDPK2(ToxoplasmagondilLZ△CDPK2)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年11月14日，保藏地址为：武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号为CCTCCNO：V201655。本专利技术的第二个目的是提供了上述一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株的制备方法，包括以下步骤：A）pSAG1::Cas9-U6::sgCDPK2质粒构建：1）利用网页软件设计CDPK2的sgRNA为GACGACTCCGGGTCCGACAC；2）利用Q5定点突变试剂盒和扩增引物，以CDPK2的sgRNA替换pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT载体中的sgUPRT，构建成pSAG1::Cas9-U6::sgCDPK2，扩增引物为gRNA-Fw:GACGACTCCGGGTCCGACACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC和gRNA-Rv:AACTTGACATCCCCATTTAC；3）PCR过程为：以pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT为模板，利用引物gRNA-Fw和gRNA-Rv进行pSAG1::Cas9-U6::sgCDPK2载体的PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃复性1min；72℃延伸5min；25个循环；4）KLD反应：反应体系为PCR产物1μl，2XKLDReactionBuffer5μl，10XKLDEnzymemix1μl，ddH2O3μl；在室温25度下反应5分钟；5）转化：将上述KLD反应产物转化到大肠杆菌DH5α中，挑取若干单菌落，提取质粒，测序鉴定，测序正确的标记为pSAG1::Cas9-U6::sgCDPK2；B）质粒大提：1）挑取含pSAG1::Cas9-U6::sgCDPK2质粒的阳性菌液于含1000U/mLAmp+的LB固体选择培养基上划线，37℃培养过夜，挑取板上的一个单菌落置于4mLLB液体选择培养基中，摇床37℃，180～220rpm培养12～16h，将上述培养菌液以1：100的比例接种到装有100mLLB培养基的500mL锥形瓶中，摇床37℃，180～220rpm培养过夜；2）将细菌培养物置于冰中或4℃冰箱3-5分钟；4℃，9500rpm离心5min，收集细菌培养物沉淀，弃上清，倒置离心管使上清尽量流出，10mL预冷的SolutionI重悬菌体，旋涡振荡，使细菌在SolutionI中完全分散；3）加入20mL新配制的SolutionII，轻摇并上下颠倒混匀3～5次，再加入15mL预冷的SolutionIII，立即轻摇混匀，以免产生局部沉淀，冰上或-20℃冰箱放置10min，加SolutionII和SolutionIII的时间间隔控制在5min以内，以免过分裂解；4℃或室温，11000rpm离心10min，利用5层纱布将上清过滤，转移到两个新50mL离心管中；4）上清与0.6倍体积异丙醇混匀，室温放置10min；室温下，11000rpm离心10min，弃上清，将空管倒置于滤纸上3-5分钟，除去残余，加入3mLddH2O充分溶解，再加入3mL预冷的5MLiCl溶液，充分混匀，两只离心管合并为一管，冰中或-20℃冰箱放置10min；4℃或室温，11000rpm离心10min，将上清分别转移到一新50mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，充分混匀，室温放置10min；4℃或室温，11000rpm离心10min，弃上清，倒置控干管内液体，倒置10～15min即可，此时管壁会出现白色沉淀物即质粒；5）加入3mLddH2O或pH8.0的TE溶液溶解沉淀，并加入30μL10mg/mL的RNaseA，37℃水浴1h除去RNA，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3MNaAc溶液，充分混匀，冰中或-20℃冰箱放置20min；4℃，11000rpm离心10min，将上清吸出，并将离心管倒置于滤纸上控干，加入100μLddH2O或pH8.0的TE溶液，充分洗脱质粒沉淀，利用分光光度计测量所得质粒的浓度并记录，分装封口后于-20℃保存备用；C）DHFR-Ts*抗性Marker的扩增：1）利用引物DHFR-Fv：AAGCTTCGCCAGGCTGTAAA和DHFR-Rv：GGAATTCATCCTGCAAGTGCATAG扩增DHFR-Ts*抗性基因，反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃复性30sec；72℃延伸3min30sec；30个循环；2）使用OMEGA普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段，利用分光光度计测量所得PCR产物的浓度并记录，分装封口后于-20℃保存备用；D）弓形虫电击转染及获取阳性单克隆：1）将Ⅱ型虫株PRU接种于75THFF细胞中，当虫子裂解细胞75%时，用细胞刮子将虫体刮起，过22G的针头3-5次释放细胞内的虫子；2）利用3.0μm的滤器过滤上述虫子去除细胞碎片，然后400g×10min离心取沉淀，利用HBSSbuffer重悬，再本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株，其特征在于，所述的CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株为LZ△CDPK2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201655。

【技术特征摘要】
1.一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株，其特征在于，所述的CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株为LZ△CDPK2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：V201655。2.根据权利要求1所述的一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A）pSAG1::Cas9-U6::sgCDPK2质粒构建：1）利用网页软件设计CDPK2的sgRNA为GACGACTCCGGGTCCGACAC；2）利用Q5定点突变试剂盒和扩增引物，以CDPK2的sgRNA替换pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT载体中的sgUPRT，构建成pSAG1::Cas9-U6::sgCDPK2，扩增引物为gRNA-Fw:GACGACTCCGGGTCCGACACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC和gRNA-Rv:AACTTGACATCCCCATTTAC；3）PCR过程为：以pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT为模板，利用引物gRNA-Fw和gRNA-Rv进行pSAG1::Cas9-U6::sgCDPK2载体的PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃复性1min；72℃延伸5min；25个循环；4）KLD反应：反应体系为PCR产物1μl，2XKLDReactionBuffer5μl，10XKLDEnzymemix1μl，ddH2O3μl；在室温25度下反应5分钟；5）转化：将上述KLD反应产物转化到大肠杆菌DH5α中，挑取若干单菌落，提取质粒，测序鉴定，测序正确的标记为pSAG1::Cas9-U6::sgCDPK2；B）质粒大提：1）挑取含pSAG1::Cas9-U6::sgCDPK2质粒的阳性菌液于含1000U/mLAmp+的LB固体选择培养基上划线，37℃培养过夜，挑取板上的一个单菌落置于4mLLB液体选择培养基中，摇床37℃，180～220rpm培养12～16h，将上述培养菌液以1：100的比例接种到装有100mLLB培养基的500mL锥形瓶中，摇床37℃，180～220rpm培养过夜；2）将细菌培养物置于冰中或4℃冰箱3-5分钟；4℃，9500rpm离心5min，收集细菌培养物沉淀，弃上清，倒置离心管使上清尽量流出，10mL预冷的SolutionI重悬菌体，旋涡振荡，使细菌在SolutionI中完全分散；3）加入20mL新配制的SolutionII，轻摇并上下颠倒混匀3～5次，再加入15mL预冷的SolutionIII，立即轻摇混匀，以免产生局部沉淀，冰上或-20℃冰箱放置10min，加SolutionII和SolutionIII的时间间隔控制在5min以内，以免过分裂解；4℃或室温，11000rpm离心10min，利用5层纱布将上清过滤，转移到两个新50mL离心管中；4）上清与0.6倍体积异丙醇混匀，室温放置10min；室温下，11000rpm离心10min，弃上清，将空管倒置于滤纸上3-5分钟，除去残余，加入3mLddH2O充分溶解，再加入3mL预冷的5MLiCl溶液，充分混匀，两只离心管合并为一管，冰中或-20℃冰箱放置10min；4℃或室温，11000rpm离心10min，将上清分别转移到一新50mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，充分混匀，室温放置10min；4℃或室温，11000rpm离心10min，弃上清，倒置控干管内液体，倒置10～15min...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄思扬，王金磊，陈凯，侯俊玲，李法财，宋慧群，朱兴全，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62