一种电激活设备及采用其的卵母细胞或者胚胎的RNA干扰新方法技术

本发明专利技术公开了一种电激活设备及采用其的卵母细胞或者胚胎的RNA干扰新方法，该电激活设备通过在平行电极（1）设置弯折部（2）以绕过小容器（3）的边缘并落入大容器（4）中。该RNA干扰新方法的步骤为：电激活槽上覆盖含有干扰RNA的电激活液F+；在电激活槽中放入待激活的卵母细胞或胚胎进行电激活；电激活结束后放入添加干扰RNA的体外操作液T2中放置1～2小时；最后放入装有化学激活液的化学激活盘中继续化学激活4～6小时，至此完成该RNA干扰过程。本发明专利技术的RNA干扰新方法简单有效，达到了RNA干扰的目的，避免了显微注射针带来的伤害，并解决了无透明带的卵母细胞或者胚胎的RNA干扰问题，节约成本和资源。

【技术实现步骤摘要】
一种电激活设备及采用其的卵母细胞或者胚胎的RNA干扰新方法
本专利技术涉及RNA干扰
，尤其是指能够同时用于有透明带的卵母细胞或者胚胎、以及无透明带的卵母细胞或者胚胎的RNA干扰新方法，具体地说是一种专门研制的电激活设备及采用其的卵母细胞或者胚胎的RNA干扰新方法。
技术介绍
RNA干扰（RNAinterfering,RNAi）是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-strandedRNA,dsRNA）引发的序列特异性基因转录后的沉默过程。具体的，细胞中核糖核酸酶III家族成员之一的dsRNA特异性核酸酶Dicer，将dsRNA裂解成由21-25个核酸组成的小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA），随后siRNA作为介导子引起相同序列的mRNA特异性降解，从而阻断相应基因表达。目前对于卵母细胞或者胚胎的RNA干扰方法主要是通过显微注射，把小片段干扰RNA注射入到卵母细胞或者胚胎的胞质或核中，从而干扰目的基因表达。这种方法需要一台昂贵的显微操作仪，对工作人员的技术要求比较高。同时在操作时需要对每个卵母细胞或胚胎做单独注射，耗费时间，劳动量大，并且对被注射的卵或胚胎有一定损伤。另外，显微操作仪只能对有透明带的卵母细胞或者胚胎做显微注射，对于无透明带的卵母细胞或者胚胎便无法实现RNA干扰。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种电激活设备及采用其的卵母细胞或者胚胎的RNA干扰新方法，该电激活设备专门为配合该卵母细胞或者胚胎的RNA干扰新方法而研制，该RNA干扰新方法无论是无透明带的卵母细胞或者胚胎、还是有透明带的卵母细胞或者胚胎都能够进行处理，干扰时每次能够同时处理10-20个卵母细胞或者胚胎，操作简单、效率较高且避免了显微注射针对卵母细胞或者胚胎的伤害。本专利技术的目的是通过以下技术方案解决的：一种电激活设备，包括平行电极，其特征在于：所述的平行电极上设有一突起的弯折部，该弯折部使得该平行电极的前端能够绕过小容器的边缘并落入大容器中，且该平行电极的前端分别与正、负电源线电性相连，使落入小容器内的平行电极之间的区域构成电激活槽。所述的弯折部至该平行电极前端的距离为整个平行电极长度的1/4～1/3，且弯折部的竖直高度不低于小容器的边缘竖直高度。位于小容器和大容器内的平行电极之间的间距固定，同时位于小容器内的平行电极的后端整体胶封且位于大容器内的平行电极的两条电极分别胶封。所述的小容器放置在大容器内。一种采用电激活设备的卵母细胞或者胚胎的RNA干扰新方法，其特征在于：所述新方法的步骤如下：a、在小容器内的平行电极上添加含有干扰RNA的电激活液F+以覆盖电激活槽，电激活液F+为0.3mol/L甘露醇、0.1mmol/L硫酸镁、0.05nmol/L氯化钙、0.01%g/L聚乙烯醇混合构成；b、将平行电极的前端连接BLS细胞融合仪的正、负电极，在电激活槽中以每组10-20个的数量放入待激活的卵母细胞或胚胎，点击BLS细胞融合仪的电源按钮进行电激活；c、电激活结束后将激活的卵母细胞或胚胎放入添加干扰RNA的体外操作液T2：HEPES-TCM199+2%CS中，放置1～2小时；d、随后把卵母细胞或胚胎放入装有化学激活液的化学激活盘中，化学激活液为胚胎体外培养液+10ug/ml放线菌酮+5ug/ml细胞松弛素B，在38.5℃、5%CO2、20%O2、100%H2O的培养箱中继续化学激活4～6小时，至此完成该RNA干扰过程。所述步骤a和步骤c中的干扰RNA为吉玛基因股份有限公司提供的FAM荧光标记的LIPIN1干扰RNA，且步骤a和步骤c中的干扰RNA的浓度为200～400nmol/L。所述步骤b中的待激活的卵母细胞或胚胎包括无透明带的卵母细胞或胚胎和有透明带的卵母细胞或者胚胎，其中无透明带的卵母细胞或胚胎的电激活参数为：0.86kV/cm、80μs、3次脉冲；有透明带的卵母细胞或者胚胎的电激活参数为：1.26kV/cm、80μs、3次脉冲。所述步骤b中的有透明带的卵母细胞或者胚胎去除透明带的过程为：把有透明带的卵母细胞或者胚胎放入1mg/mL链酶蛋白酶中消化2～3min，接着交替在体外操作液T20：HEPES-TCM199+20%CS、体外操作液T2：HEPES-TCM199+2%CS中依次分别洗2～3遍，每遍30s，透明带被消化后将无透明带的卵母细胞或胚胎保存在体外操作液T2中备用。所述步骤a中的添加100～150ul的电激活液F+覆盖电激活槽后，再在电激活液F+上覆盖石蜡油以防电激活液F+挥发。所述步骤a、步骤b、步骤c的处理过程在18℃-25℃的温度下进行。本专利技术相比现有技术有如下优点：本专利技术的电激活设备通过在平行电极上设置一个弯折部，使得连接正、负电源线的平行电极前端与构成电激活槽的平行电极得以分离构成一种新型结构的电激活设备，该电激活设备的电激活槽能够同时处理10-20个卵母细胞或者胚胎，操作简单、效率较高。本专利技术提供的卵母细胞或者胚胎的RNA干扰新方法简单有效，达到了RNA干扰的目的，避免了显微注射针对卵母细胞或者胚胎的伤害，并解决了无透明带的卵母细胞或者胚胎的RNA干扰问题，节约成本和资源。附图说明附图1为本专利技术的电激活设备结构示意图；附图2为本专利技术的电激活设备应用在RNA干扰新方法中覆盖电激活液时的状态示意图；附图3为本专利技术的实施例一-实施例五，分别是在F+和T2培养液中不同的方式添加用FAM标记的干扰RNA后，收集化学激活后24小时的胚胎，4%多聚甲醛固定半小时，用PBS（磷酸盐缓冲溶液）压片，并用激光共聚焦显微镜拍照后得到的效果图；附图4为本专利技术的实施例六的，针对LIPIN1的mRNA设计了三个干扰RNA，分别是LIPIN1-pig-85、LIPIN1-pig-242和LIPIN1-pig-586，收集化学激活后24小时样品，提取mRNA，反转录成cDNA,通过荧光定量PCR对RNA干扰后基因表达情况进行统计分析；附图5为本专利技术的实施例七的为了筛选出最佳的干扰浓度，分别设置了空白对照（control）,阴性对照（RNAinegativecontrol与哺乳动物基因无同源性，）200nM,400nM,600nM,800nM的浓度，对无透明带的卵母细胞进行干扰，收集化学激活后24小时的样品，提取mRNA，反转录成cDNA,通过荧光定量PCR对不同浓度RNA干扰后基因表达情况进行统计分析。其中：1—平行电极；2—弯折部；3—小容器；4—大容器；5—电激活槽。具体实施方式下面结合附图与实施例对本专利技术作进一步的说明。如图1所示：一种电激活设备，包括平行电极1、小容器3和大容器4，小容器3放置在大容器4内，在平行电极1上设有一突起的弯折部2，该弯折部2至该平行电极1前端的距离为整个平行电极1长度的1/4～1/3，且弯折部2的竖直高度大于小容器3的边缘竖直高度，弯折部2使得该平行电极1的前端能够绕过小容器3的边缘并落入大容器4中，且该平行电极1的前端分别与正、负电源线电性相连，落入小容器3内的平行电极2之间的区域构成电激活槽5；另外位于小容器3和大容器4内的平行电极2之间的间距固定，同时位于小容器3内的平行电极2的后端整体胶封且位于大容器4内的平行电极1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种电激活设备，包括平行电极（1），其特征在于：所述的平行电极（1）上设有一突起的弯折部（2），该弯折部（2）使得该平行电极（1）的前端能够绕过小容器（3）的边缘并落入大容器（4）中，且该平行电极（1）的前端分别与正、负电源线电性相连，使落入小容器（3）内的平行电极（2）之间的区域构成电激活槽（5）。

【技术特征摘要】
1.一种电激活设备，包括平行电极（1），其特征在于：所述的平行电极（1）上设有一突起的弯折部（2），该弯折部（2）使得该平行电极（1）的前端能够绕过小容器（3）的边缘并落入大容器（4）中，且该平行电极（1）的前端分别与正、负电源线电性相连，使落入小容器（3）内的平行电极（2）之间的区域构成电激活槽（5）。2.根据权利要求1所述的电激活设备，其特征在于：所述的弯折部（2）至该平行电极（1）前端的距离为整个平行电极（1）长度的1/4～1/3，且弯折部（2）的高度不低于小容器（3）的边缘竖直高度。3.根据权利要求1所述的电激活设备，其特征在于：位于小容器（3）和大容器（4）内的平行电极（2）之间的间距固定，同时位于小容器（3）内的平行电极（2）的后端整体胶封且位于大容器（4）内的平行电极（1）的两条电极分别胶封。4.根据权利要求1所述的电激活设备，其特征在于：所述的小容器（3）放置在大容器（4）内。5.一种采用权利要求1-4任一所述电激活设备的卵母细胞或者胚胎的RNA干扰新方法，其特征在于：所述新方法的步骤如下：a、在小容器内的平行电极上添加含有干扰RNA的电激活液F+以覆盖电激活槽，电激活液F+为0.3mol/L甘露醇、0.1mmol/L硫酸镁、0.05nmol/L氯化钙、0.01%g/L聚乙烯醇混合构成；b、将平行电极的前端连接BLS细胞融合仪的正、负电极，在电激活槽中以每组10-20个的数量放入待激活的卵母细胞或胚胎，点击BLS细胞融合仪的电源按钮进行电激活；c、电激活结束后将激活的卵母细胞或胚胎放入添加干扰RNA的体外操作液T2：HEPES-TCM199+2%CS中，放置1～2小时；d、随后把卵母细胞或胚胎放入装有化学激活液的化学激活盘中，化学激活液为胚胎体外培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娟，曾亚琼，陈宝宝，迟大明，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32