基于海藻胶液滴的数字PCR芯片及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种液滴捕获芯片，其包括多个平行排列的流体微通道，其中，沿着所述流体微通道间隔地形成多个液滴捕获结构，所述液滴捕获结构包括液滴进入端以及抑制液滴流出端，抑制液滴流出端与相邻的流体微通道相连通。本发明专利技术还公开了全集成的基于海藻胶液滴的数字PCR芯片及其应用，本发明专利技术的基于海藻胶的数字PCR芯片，可以完成从液滴生成到捕获以及检测的全过程。并且引入海藻胶，海藻胶凝固后，海藻胶液滴稳定、不会发生融合并且不会影响PCR的扩增效率，该方法可以应用到血液中循环肿瘤DNA的检测以及其他相关生物、医学的应用，由于海藻胶的引入，可以进一步扩展应用到单细胞分析等。

【技术实现步骤摘要】
基于海藻胶液滴的数字PCR芯片及其应用
本专利技术属于微流控
，尤其涉及一种基于海藻胶液滴的数字PCR芯片及其应用。
技术介绍
微流控技术是多学科交叉的科技前沿领域之一，具有尺寸小、效率高、集成度高、分析速度快、价格低廉等一系列特点。液滴微流控是微流控技术的重要分支，微流控液滴系统为单细胞分析提供了一个潜在的工具，利用微流控系统，可对单细胞进行快速分割和高通量平行观察检测。利用微流控液滴进行细胞培养已经是比较成熟的技术，采用特定的微通道设计如捕获阵列、培养小室、微孔阵列来固定微液滴，可以实现在线细胞培养，整个实验过程中细胞的相对位置不会发生变化。基于微流控芯片的液滴数字PCR(dropletdigitalPCR,ddPCR)是近年发展起来的高灵敏的核酸检测分析技术，受到广泛重视。ddPCR将含有待测核酸分子的反应体系包入成千上万10-12-10-9升的油包水型液滴，根据泊松分布原理，合理控制反应物浓度，绝大多数液滴不含或最多只包含1个待测核酸分子，PCR扩增之后，只有包含待测核酸分子的液滴才能产生荧光信号。对荧光信号呈阳性的液滴逐个计数，即得到样本中待测核酸分子的拷贝数。由于ddPCR是在单分子层面绝对定量待测核酸分子，大大提高了检测的灵敏度和结果的准确性，特别适用于微量核酸的检测和定量分析。国际市场上，基于液滴数字PCR技术已经研发成功的公司有Bio-Rad、Fluidigm，LifeTechnoligies和Raindance,其中Bio-Rad公司已经成为数字PCR领域的市场领导者，但其高昂的仪器价格，使得很多实验室望而却步。Bio-Rad的液滴PCR仪从液滴生成，核酸扩增，荧光检测都是不同的仪器操作，从而增加了操作的繁琐性，并且每一步骤都带入了样品转移引起的损耗，降低了集成度，既增加了操作时间，也增加了仪器成本。
技术实现思路
一方面，本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种液滴捕获芯片，本专利技术的液滴捕获芯片可有效减少堵塞，可结合海藻胶液滴使用。一种液滴捕获芯片，其包括多个平行排列的流体微通道，其中，沿着所述流体微通道间隔地形成多个液滴捕获结构，所述液滴捕获结构包括液滴进入端以及抑制液滴流出端，抑制液滴流出端与相邻的流体微通道相连通；每个流体微通道的两端分别设有第一入口和第一出口；垂直于流体微通道的两侧分别设有多个并行排列的第二入口和第二出口，用于施加垂直于流体微通道的方向上的压力以允许液滴进入液滴捕获结构。作为对上述技术方案的进一步改进，所述液滴捕获结构为底部设有开口的U型结构，所述液滴进入端位于U型结构的顶部开口处，所述抑制液滴流出端位于U型结构的底部开口处。作为对上述技术方案的进一步改进，所述抑制液滴流出端的宽度为10-30μm，所述液滴进入端的宽度为80-120μm。为对上述技术方案的更进一步改进，所述抑制液滴流出端的宽度为20μm，所述液滴进入端的宽度为110μm。作为对上述技术方案的进一步改进，所述流体微通道设有50-200行，每行流体微通道设有50-200个液滴捕获结构。作为对上述技术方案的进一步改进，相邻两条流体微通道的液滴捕获结构交叉布设，其中，一条流体微通道的液滴捕获结构的抑制液滴流出端与另一条流体微通道的两个液滴捕获结构之间的空隙相对应。作为对上述技术方案的进一步改进，所述第一入口、第一出口、第二入口和第二出口分别通过多支路汇集通道形成第一总入口、第一总出口、第二总入口和第二总出口。另一方面，本专利技术还提供了一种基于海藻胶液滴的数字PCR芯片，其中，所述数字PCR芯片包括以上所述的液滴捕获芯片，所述数字PCR芯片还包括液滴生成芯片，所述液滴生成芯片包括液滴生成区、第一进液通道、第二进液通道和出液通道；所述第一进液通道的一端、第二进液通道的一端和出液通道的一端汇集于所述液滴生成区上，所述第一进液通道的另一端设有第一进液口，所述第二进液通道的另一端设有第二进液口，所述出液通道的另一端与由所述流体微通道经多支路汇集形成的总通道连通。作为对上述技术方案的进一步改进，所述第一进液通道、第二进液通道和出液通道之间的连通采用T型通道结构。作为对上述技术方案的进一步改进，所述出液通道包括一段弯曲通道，用于使液滴内的物质充分混合。作为对上述技术方案的更进一步改进，所述弯曲通道的长度为1mm，宽度为120μm。再一方面，本专利技术还提供了一种核酸扩增反应方法，包括：(1)提供以上所述的基于海藻胶液滴的数字PCR芯片；(2)分别向所述数字PCR芯片的第一进液口和第二进液口中加入分散相和连续相，所述分散相包含海藻胶单体、PCR反应液，所述连续相包含油相，所述分散相和连续相中存在着接触反应后能够使海藻胶单体发生交联的物质；分散相和连续相分别流经第一进液通道、第二进液通道，接触后在液滴生成区生成海藻胶液滴，随后海藻胶液滴经流体微通道被捕获至液滴捕获腔室；(3)将海藻胶液滴控制在适合PCR反应的温度下，进行原位扩增反应。所述步骤(3)中，将海藻胶液滴控制在适合PCR反应的温度下可通过多种方式实现，例如在基于海藻胶液滴的数字PCR芯片下放置温度控制的模块，相当于一个加热板，芯片在加热板上，通过控制加热板的温度实现原位扩增。作为对上述技术方案的进一步改进，所述能够使海藻胶单体发生交联的物质为碳酸钙纳米颗粒和乙酸，其中，碳酸钙纳米颗粒包含在分散相中，乙酸包含在连续相中。作为对上述技术方案的进一步改进，所述油相包含油和表面活性剂。优选地，所述油选自矿物油、氟化硅油中的至少一种。所述表面活性剂选择---中的至少一种。作为对上述技术方案的进一步改进，所述分散相还包含K+和Na+中的至少一种。更优选地，所述水性组分还包含K+和Na+。K+和Na+可去除海藻胶对PCR的抑制作用。最优选地，所述水性组分中，K+的浓度为7mM，Na+的浓度为75mM，在此浓度值时的K+和Na+在去除海藻胶对PCR的抑制作用方面效果最佳。又一方面，本专利技术还提供了以上所述的基于海藻胶液滴的数字PCR芯片在核酸扩增反应中的应用。又一方面，本专利技术还提供了海藻胶液滴在液滴数字PCR中的应用。以上所述的海藻胶液滴包含海藻胶微球以及包围所述海藻胶微球的油性组分；所述海藻胶微球包括由海藻胶单体交联形成的海藻胶骨架以及分散在海藻胶骨架内的水性组分。作为对上述技术方案的进一步改进，所述水性组分包含一个或更少的靶核酸和足以进行聚合酶链式反应的溶剂。在一个典型的实施方式中，聚合酶链式反应的溶剂包括扩增缓冲液、4种dNTP混合物、引物、DNA聚合酶、Mg2+和双蒸水。作为对上述技术方案的更进一步改进，所述水性组分还包含K+和Na+中的至少一种。更优选地，所述水性组分还包含K+和Na+。K+和Na+可去除海藻胶对PCR的抑制作用。最优选地，所述水性组分中，K+的浓度为7mM，Na+的浓度为75mM，在此浓度值时的K+和Na+在去除海藻胶对PCR的抑制作用方面效果最佳。作为对上述技术方案的进一步改进，所述油性组分包含油和表面活性剂，优选地，所述表面活性剂选自span80、tween20中的至少一种；所述油选自矿物油、氟化硅油中的至少一种。作为对上述技术方案的进一步改进，所述海藻胶液滴的尺寸大小为10-200μm。以上所述的海藻胶液滴的生成方法，包本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种液滴捕获芯片，其特征在于：包括多个平行排列的流体微通道，其中，沿着所述流体微通道间隔地形成多个液滴捕获结构，所述液滴捕获结构包括液滴进入端以及抑制液滴流出端，抑制液滴流出端与相邻的流体微通道相连通；每个流体微通道的两端分别设有第一入口和第一出口；垂直于流体微通道的两侧分别设有多个并行排列的第二入口和第二出口，用于施加垂直于流体微通道的方向上的压力以允许液滴进入液滴捕获结构。

【技术特征摘要】
1.一种液滴捕获芯片，其特征在于：包括多个平行排列的流体微通道，其中，沿着所述流体微通道间隔地形成多个液滴捕获结构，所述液滴捕获结构包括液滴进入端以及抑制液滴流出端，抑制液滴流出端与相邻的流体微通道相连通；每个流体微通道的两端分别设有第一入口和第一出口；垂直于流体微通道的两侧分别设有多个并行排列的第二入口和第二出口，用于施加垂直于流体微通道的方向上的压力以允许液滴进入液滴捕获结构。2.根据权利要求1所述的液滴捕获芯片，其特征在于：所述液滴捕获结构为底部设有开口的U型结构，所述液滴进入端位于U型结构的顶部开口处，所述抑制液滴流出端位于U型结构的底部开口处。3.根据权利要求1所述的液滴捕获芯片，其特征在于：所述抑制液滴流出端的宽度为10-30μm，所述液滴进入端的宽度为80-120μm。4.根据权利要求3所述的液滴捕获芯片，其特征在于：所述抑制液滴流出端的宽度为20μm，所述液滴进入端的宽度为110μm。5.根据权利要求1所述的液滴捕获芯片，其特征在于：所述流体微通道设有50-200行，每行流体微通道设有50-200个液滴捕获结构。6.根据权利要求1所述的液滴捕获芯片，其特征在于：相邻两条流体微通道的液滴捕获结构交叉布设，其中，一条流体微通道的液滴捕获结构的抑制液滴流出端与另一条流体微通道的两个液滴捕获结构之间的空隙相对应。7.根据权利要求1所述的液滴捕获芯片，其特征在于：所述第一入口、第一出口、第二入口和第二出口分别通过多支路汇集通道形成第一总入口、第一总出口、第二总入口和第二总出口。8.一种基于海藻胶液滴的数字PCR芯片，其特征在于：所述数字PCR芯片包括根据权利要求1～7中任一项所述的液滴捕获芯片，所述数字PCR芯片还包括液滴生成芯片，所述液滴生成芯片包括液滴生成区、第一进液通道、第二进液通道和出液通道；所述第一进液通道的一端、第二进液通道的一端和出液通道的一端汇集于所述液滴生成区上，所述第一进液...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴天准，李丽军，於林芬，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44