含有来自乙肝病毒X蛋白的肽抗原的脂质体制造技术

本发明专利技术涉及其中含有新型肽抗原的脂质体，这些肽抗原在调节人体针对乙肝病毒（ＨＢＶ）的免疫反应中发挥作用，更具体地说，本发明专利技术涉及对应于来自ＨＢＶＸ蛋白中抗原表位的肽类群，这些肽能诱导产生针对上述病毒的细胞毒性Ｔ淋巴细胞（“ＣＴＬ”）或免疫耐受：本发明专利技术还涉及含有所述肽类群的ｐＨ－敏感性脂质体，所述肽类群能够激发细胞免疫从而产生特异于上述病毒的ＣＴＬ。由于Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６和Ｘ７等来自Ｘ蛋白的肽抗原能够激活可识别人体内出现的ＨＢＶ抗原的ＣＴＬ，而且也能被ＣＴＬ识别，所以上述脂质体可以用于开发能用来预防和治疗ＨＢＶ－相关疾病的治疗性制剂。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
专利
本专利技术涉及其中含有新型肽抗原的脂质体，这些肽抗原在调节人体针对乙肝病毒(HBV)的免疫反应中发挥作用，更具体地说，本专利技术涉及对应于来自HBV X蛋白中抗原表位的肽类群，这些肽能诱导产生针对上述病毒的细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)或免疫耐受性；本专利技术还涉及含有所述肽类群的pH-敏感性脂质体，所述肽类群能够激发细胞免疫从而产生特异于上述病毒的CTL。现有技术当人体受HBV感染时，会激发各种生理反应来清除该病毒。在这些反应中，最重要的反应之一就是破坏或清除已受感染的细胞，最终导致病毒感染的恢复。已受感染细胞的破坏离不开另一种被成为CTL的具有细胞毒性的细胞。CTL展示细胞毒性的前提条件是它们必须首先识别入侵病毒蛋白中的一些肽。通常，病毒蛋白在受感染细胞内合成，然后通过细胞内的降解过程转化为含8～15个氨基酸的短肽。因此，当上述的一些肽与胞内主要组织相容性复合体(“MHC”)以结合体的形式出现在细胞表面时，CTL能够识别它们从而破坏受感染的细胞。另一方面，MHC分为Ⅰ类和Ⅱ类MHC，与Ⅱ类MHC相比，已知Ⅰ类MHC在诱导CTL方面发挥重要作用。但是，有报道指出在病毒蛋白降解产生的众多肽中，能够为CTL所识别的蛋白(肽)的位点仅限于其中含有特异性氨基酸序列的肽(参见Fremont，D.等人，《科学》257919-926(1992)；Matsumura，M.等人，《科学》257929-934(1992))。因此，发现这些特异性位点的氨基酸序列就可以化学合成并制备出具有相应氨基酸序列的肽，所以可以用这些肽人工诱导产生能够特异性地识别人体内肝炎病毒的CTL或者调节免疫抑制等其他免疫应答，从而有效地预防及治疗由肝炎病毒诱发的疾病。在这些认识的基础上，许多的研究人员都致力于从肝炎病毒蛋白降解产生的肽中发现能够为CTL所识别的肽的氨基酸序列。因此，已经发现了几个特异性的氨基酸序列，并预期会进一步发现更多的序列。此外，为了将这些肽应用于肝炎-相关疾病的预防和治疗中，就需要同时使用尽可能多的肽，这些肽的效能可能各不相同，这取决于肽的种类。因此，发现这些肽的氨基酸序列具有十分重要的意义。现已报道过能被CTL识别并可用于预防和治疗乙肝的肽主要来自HBV的S(表面抗原)蛋白和C(核心)蛋白。但是，尽管一系列使用转基因小鼠的试验都清楚地揭示出X蛋白与HBV-相关的肝癌直接有关(参见Hoyhne等人，EMBO J.，91137-1145(1990)；Kim等人，《自然》，351317-320(1991))，但是至今来自X蛋白的肽还未见报道，X蛋白是一个HBV的抗原蛋白。另一方面，当磷脂分散在水中时，极性的头部基团朝向水，而疏水的尾部通过疏水作用聚集在一起，自发地形成双层球状密闭囊泡，称为“脂质体”。这样的脂质体已经广泛地用作药物传递系统中的载体以及生物膜的研究模型(参见Lee，J.W.and Kim，H.，Arch.Biochem.Biophys.，297354(1992)；Hahn，K.H.and Kim，H.，生物化学杂志，110635(1991)；Yun，C.H.and Kim，H.，生物化学杂志，105406(1989)；Kim，J.and Kim，H.，《生物化学》，257867(1986)；Kim，J.and Kim，H.，韩国生物化学杂志，18403(1985))。最近，已有报道说脂质体可以用于免疫学领域，从而加速了用脂质体作为疫苗或佐剂的载体的研究(参见Rooijen，NV.，《疫苗》，111170(1993))。通常，当静脉内注入脂质体时，它们很容易被血液中富含的巨噬细胞(“MO”)捕获，巨噬细胞在脂质体抗原的加工以及抗原的免疫处理工程中发挥着重要的作用。另外，可以用于诱导CTL应答的方法最近已发展起来，CTL应答特异性地针对pH-敏感性脂质体中所使用的特定蛋白或肽(参见Readdy，R.等人，免疫方法杂志，141157(1991)；Zhou，F.等人，免疫方法杂志，145143(1991)；Nair，S.等人，J.Exp.Med.，175609(1992)；Harding，C.V.等人，免疫学杂志1472860(1991)；Zhou，F.and Huang，L.，《疫苗》，111139(1993))，而且pH-敏感性脂质体已被广泛地用作蛋白或肽抗原的载体及佐剂系统，用来制备亚单位疫苗。在这一点上，本专利技术人已经报道了一种用于制备pH-敏感性脂质体的方法，该脂质体允许抗癌药物的选择性转运(参见Choi，M.J.等人，生物化学杂志，112694(1992))。专利技术概述根据本专利技术，在来自HBVX蛋白的众多肽中，提供了一系列可被CTL特异性识别的肽。而且，还提供了其中含有来自HBV X蛋白的肽抗原的pH-敏感性脂质体。本专利技术人发现所述脂质体可以用于开发上述治疗性制剂，该试剂通过激发细胞免疫而生成特异于上述HBV肽抗原的CTL，从而达到预防和治疗HBV-相关疾病的目的。因此，本专利技术的一个主要目的是提供来自HBV X蛋白的肽抗原，该肽抗原可被CTL识别并对病毒表现出细胞毒性。本专利技术的另一个目的是提供pH-敏感性脂质体，其中含有上述能够激发细胞免疫的肽抗原。附图简述结合附图，可以从下列给出的描述中清楚地理解出本专利技术的上述及其他目的和特征，其中附图说明图1显示了在T2细胞表面表达的MHC Ⅰ类分子的变化，用荧光强度来表示。图2图示了CTL针对T2细胞的细胞毒性。图3(A)显示的是用人肝细胞癌接种的裸鼠的致瘤性。图3(B)显示的是，在以来自HBV X蛋白的肽抗原激发的CTL处理后裸鼠中的肿瘤清除情况。专利技术详述基于此前发现的结合到MHC Ⅰ类分子上的肽具有特异性的氨基酸序列，从HBV X蛋白的全长氨基酸序列中，测定出具有结合MHC Ⅰ类分子潜能的肽的序列。也就是说，由于能够结合HLA-A2这样一种人MHC Ⅰ类分子的肽在C-末端或N-端第二位上具有亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸(参见Matsumura，M.等人，《科学》，257929-934(1992))，所以从HBV X蛋白的全长氨基酸序列中筛选出满足上述条件的氨基酸序列，在该分子三维结构的基础上，从HBV X蛋白降解后产生的众多肽中，选择出具有结合HLA-A2潜能的肽，即能够通过结合人MHCⅠ类分子而激发CTL应答的肽抗原(参见下列表1)。然后，根据这样测定出的氨基酸序列，化学合成出肽。下列表1中给出了来自HBVX蛋白的肽，即X3、X4、XS、X6和X7的氨基酸序列。表1HBV X蛋白降解后产生的肽中可被CTL识别的肽的位置及氨基酸序列 *氨基酸序列根据IUPAC-IBU命名系统缩写。本专利技术不仅包括上述9个氨基酸组成的肽，而且还包括在这些肽的N-或C-末端添加1～5个氨基酸得到的肽以及它们的功能等同物。在本专利技术中，“功能等同物”一词可以用来指代在上述肽的氨基酸序列中取代1或2个氨基酸后得到的所有的肽。例如，取代包括下列的氨基酸组合，例如Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和，Phe，Tyr。为了制备出其中含有来自HBV X蛋白的肽抗原的pH-敏感性脂质体，按照6∶4～8∶2，最优选7∶3的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来自乙肝病毒Ｘ蛋白的肽，这种肽被细胞毒性Ｔ淋巴细胞所识别而表现出针对乙肝病毒的细胞毒性，所述肽的氨基酸序列为（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）：Ｈ Ｌ Ｓ Ｌ Ｒ Ｇ Ｌ Ｆ Ｖ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金泰演，李起永，张珍洙，赵诚惟，黄琉炅，崔明俊，郑弘锡，
申请(专利权)人：牧岩生命工学研究所，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]