与短肽激素嵌合的靶特异性细胞毒性剂制造技术

本发明专利技术涉及以包括促性腺素释放激素和促黑色素释放激素在内的短肽类激素作为导向剂，并以重组假单胞菌外毒素为细胞毒性剂的嵌合毒素，其制备方法及在治疗性腺反应性或非反应性肿瘤中的应用，特征在于其中所说的嵌合毒素的导向部分是以两分子串联连接的。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术总地涉及具有靶细胞特异性细胞毒性的融合蛋白质。更具体地说，本专利技术涉及与短肽类激素融合的重组假单胞菌外毒素A(rPE)的构建，以及所说的重组细胞毒性融合蛋白作为抗肿瘤剂，在抑制类固醇激素刺激的肿瘤和黑色素瘤的发生和发育中的应用。传统的肿瘤治疗方法是使用化学药物直接杀伤体内的肿瘤细胞。然而，大多数抗肿瘤药物在杀伤肿瘤的同时还杀伤正常细胞。为了提高抗肿瘤药物对肿瘤细胞的选择性，自20世纪70年代后期以来，人们就试图将某些抗肿瘤药物或本来缺乏靶向选择性的毒素(包括细菌或植物来源的毒素)化学偶联到适当的导向分子或称识别分子上，以制备杂交的具有靶特异性的抗肿瘤剂。随着分子生物学技术的发展，进而建立了以DNA重组技术制备这样的融合蛋白质的方法。在肿瘤的发生和发育过程中，许多肿瘤细胞都在其表面上过量表达生长因子受体蛋白质，例如表皮生长因子受体(EGF-R)和转化生长因子α受体(TGFα-R)。因此，可将某些细胞毒性剂(如假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素、霍乱毒素、葡萄球菌内毒素及蓖麻毒素等)连接到作为导向剂的EGF、TGF-α或bFGF分子上，以产生兼有肿瘤细胞导向功能和细胞毒活性的杂交分子。这些杂交分子借助其对靶肿瘤细胞导向能力将整个分子引向靶细胞并通过其毒素部分杀伤靶细胞。目前研究较多且较深入的细胞毒性剂是假单胞菌外毒素A(PE)(参见美国专利4，545，985)。PE是由613个氨基酸组成的单链多肽。对PE分子的X射线晶体学研究和突变分析显示，PE分子包括三个与产生细胞毒性相关的结构区域负责与敏感细胞结合的氨基末端细胞受体结合区(Ⅰ区)；负责毒素分子向细胞溶胶内转位的中间转位区(Ⅱ区)以及负责失活蛋白质并最终导致细胞死亡的羧基末端酶促活性区(Ⅲ区)。其中Ⅰ区包括介导细胞结合的Ⅰa区(氨基酸1-252)和目前尚未明确其功能的Ⅰb区(氨基酸365-399)。可以使用生物化学或重组DNA技术修饰PE分子，以制备PE分子中有一个或多个氨基酸缺失或取代的各种修饰的PE片段，例如，一般将删去了PE分子中Ⅰa区，只含有酶促和转位区，分子量约为40KDa的PE-A蛋白质称为PE40。现已发现删除PE的Ⅰa和大部分Ⅰb区(氨基酸365-380)后，毒素分子仍保留其特异性细胞毒性，但降低了非特异性毒性(例如参见Hwang et al．，Cell 48129-136，1987；美国专利4，892，827和欧洲专利0261671)。许多现有技术文献已描述了PE与各种生长因子、抗体、激素或CD4融合，以产生可选择性地导向并杀伤具有不同细胞膜蛋白(受体或抗原)之靶细胞的杂交蛋白质的方法(参见Pastan and Fitz．G．，Science 2541173-1177，1991)。例如，Chaudhary等人(PNAS USA 844538-4542，1987)描述了PE40与TGFα间形成的杂交体融合蛋白质(TGFα-PE40)。TGFα-PE40的临床实用性依赖于其结合并杀伤具有表皮生长因子受体之细胞的能力。Murphy等人(PNAS USA 838258-8262，1986)描述了白喉毒素-α促黑素(MSH)融合蛋白质的基因构建、表达及其黑色素瘤选择性细胞毒性。美国专利5，428，143公开了用于选择性杀伤HIV感染之细胞的杂交蛋白质及编码该杂交蛋白质的嵌合基因的构建。其中所说的杂交蛋白质由含有HIV结合位点的人CD4和可杀死HIV感染之细胞毒性蛋白质(PE40)组成。作为与本专利技术更为相关的现有技术，国际专利WO93／15751公开了将促性腺素释放激素(GnRH)肽直接偶联到假单胞菌外毒素分子上制成的嵌合蛋白质分子。据称，投用这样的嵌合分子可导致脑垂体中携带GnRH受体的细胞的破坏，并伴有性激素分泌的降低，因而可望将其用于动物不育化及抑制类固醇激素相关肿瘤的增殖。另外，国际专利申请WO97／15325描述了一种含有与假单胞外毒素化学结合的GnRH的免疫原性载体系统，以其作为疫苗可在动物体内诱发产生高浓度抗GnRH抗体，因而可用于控制受孕、减少生殖激素驱动的行为及治疗类固醇激素反应性肿瘤。本专利技术的一个目的是提供一种由短肽类激素与重组假单胞菌外毒素融合而成的嵌合毒素，特征在于其中所说的短肽类激素部分作为导向剂，可与其表面上具有相应激素受体的外周性腺激素反应性或非反应性肿瘤细胞特异结合，并且当内化到这些肿瘤细胞中之后，所说的假单胞菌外毒素部分作为细胞毒性剂可有效地杀伤这些肿瘤靶细胞。根据本专利技术这一目的的一个优选实施方案，其中所说的短肽类促激素是促性腺素释放激素(GnRH)和黑色素刺激激素(MSH)。根据本专利技术这一目的的一个优选实施方案，其中所说的重组假单胞外毒素是PE40。根据本专利技术这一目的的一个优选实施方案，其中所说的GnRH和MSH分子是以两分子串联形式连接到PE分子中相当于Ⅰa区的位置。本专利技术的另一个目的是提供含有细胞毒性有效量的上述GnRH-PE40或MSH-PE40嵌合毒素，以及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。本专利技术的再一个目的涉及上述药物组合物在治疗性腺激素反应性或非反应性肿瘤中的应用。附图说明图1a显示用于表达GnRH-PE40的重组质粒的构建。图1b显示用于表达2×GnRH-PE40的重组质粒的构建。图2显示部分纯化的GnRH-PE40对某些性激素反应性或非反应性组织来源的肿瘤细胞及某些正常组织原代细胞培养物的蛋白质合成的影响。■乳腺癌MCF-7细胞；●肝癌HepG-2细胞；▲结肠癌Caco2细胞；※子宫颈癌Hela细胞；○小牛睾丸细胞；△小鼠胸腺细胞；□小鼠腹腔巨噬细胞；⊙人子宫颈细胞。图3显示部分纯化的GnRH-PE40(●)和2×GnRH-PE40(○)对125I-GnRH与Hela细胞膜结合的竞争结合能力。图4显示用于表达2×MSH-PE40的重组质粒的构建。图5显示部分纯化的MSH-PE40或2×MSH-PE40分别对黑色素瘤B16细胞(●或○)和原代培养的正常小鼠黑色素细胞(▲或△)的蛋白质合成的抑制。数值以在不同浓度MSH-PE40或2×MSH-PE40存在下(横坐标)，特异性嵌合毒素蛋白质抑制恶性细胞蛋白质合成占良性对照组细胞的百分率(纵坐标)表示。本文中所使用术语“导向剂”，是指能够只与待杀伤的靶细胞表面上的受体或抗原特异结合的分子或配体。“导向剂”有时也称为“识别分子”或“配体结合剂”。这样的识别分子的例子是可识别靶细胞的抗体或其片段，可与靶细胞上的分子特异结合的生长因子、淋巴因子、细胞因子、抗原及激素等。根据本专利技术的优选实施方案，所说的导向剂是激素，较好是小分子短肽类激素，并且最好是促性腺素释放激素(GnRH)和促黑素(MSH)。本文所使用的术语“GnRH”是指能够与其表面上具有类固醇激素受体的细胞结合，并且当以高剂量投用于哺乳动物宿主时能引发抗GnRH抗体产生的天然GnRH及其类似物或衍生物。天然GnRH也称为促黄体素释放激素(LHRH或LRH)，其为具有下示氨基酸序列的十肽分子pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2式中所用的氨基酸符号为本领域通用的三字母缩写符号，并且其中的pGlu代表焦谷氨酸。可适用本文档来自技高网...

【技术保护点】
由短肽激素与重组假单胞菌外毒素融合而成的嵌合毒素，特征在于其中所说的短肽类激素部分作为导向剂，可与其表面具有相应激素受体或其他配体的性腺激素反应性或非反应性肿瘤细胞特异地结合，并且当内化到这些肿瘤细胞中之后，所说的重组假单胞菌外毒素部分作为细胞毒性剂可有效地杀伤这些肿瘤靶细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱平，孟锐奇，朱冬冬，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]