本文公开了共价反应性抗原类似物。可以使用本发明专利技术的抗原刺激催化性抗体的产生，所述催化性抗体对预定的与特定医学疾病相关的抗原是特异性的。也可以使用所述抗原类似物使内源产生的催化性抗体永久性失活，所述催化性抗体在某些自身免疫病以及在某些淋巴组织增生疾病中产生。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫学、分子生物学和医学领域。更具体地说，本专利技术提供刺激产生新催化性抗体及其抑制物的新方法和组合物。本专利技术也提供鉴别和分离天然产生的由种系基因表达的催化性抗体的方法。最后，本专利技术提供合成共价反应性抗原类似物的方法，所述共价反应性抗原类似物刺激产生催化性抗体和/或不可逆地抑制其活性。
技术介绍
为了更充分地描述本专利技术所属领域的状况，在本申请中通过括号中的数字引用了几个出版物。这些出版物每一个的说明书都通过引用结合到本文中。关于来自气喘患者的抗体切割血管活性肠肽(VIP)的发现提供了抗体可能具有肽酶活性的早期证据。该发现已经由Suzuki等人独立地再现。自身抗体催化不限于对VIP的催化。在Hashimoto甲状腺炎中的自身抗体催化甲状腺球蛋白的切割。对狼疮患者抗体中的DNA酶活性的报道，已经提供了关于自身抗体催化的进一步的证据。具有自身免疫病遗传素因的小鼠品系当与对照小鼠品系相比时，产生较高水平的对用过渡态类似物免疫应答的酯酶抗体，这一发现支持对自身免疫病中的催化性抗体合成的看法。同非催化性抗体一样，肽酶抗体能够在VL和VH区的残基上结合通过接触介导的高度特异性的抗原。纯化的H和L亚基尽管亲合性低于亲代抗体，但已知它们能够非依赖性地结合抗原。抗体-抗原复合物的X射线晶体学已经表明，VL和VH区都参与结合抗原。在个别的抗体-抗原复合物中所述两个V区所起的准确作用有所不同，但VH区可能以略高的水平起作用，因为CDRH3与CDRL3相比在序列上有更长和更易变的趋势。肽酶抗体首先与多肽抗原复合，接着切割一个或多个肽键。就在切割前，以过渡态的肽键建立与所述抗体的催化性残基的接触。水解肽键的能力似乎存在于VL区。此结论是基于由多克隆自身抗体的L链、由多发性骨髓瘤患者中分离出的单克隆L链及其重组VL区和通过用VIP免疫产生的重组L链切割VIP。针对VIP的多克隆抗体和单克隆抗体的H链能够结合VIP，但没有催化活性。不过VH区仍可以通过“遥控”影响肽酶活性，因为在结合远离切割位点的VIP时，所述VH区可以影响显示Fv构成物的肽酶活性的结合位点的构象，所述Fv构成物由与其VH区连接的催化性抗-VIP VL区组成。所述抗-VIP VH区对催化活性发挥有益的作用，而不相关的VH区对催化活性施加有害作用，这由VIP结合亲合力值和催化效率值评价。所提出的在催化性抗体中存在的特殊催化亚位点(subsite)和抗原结合亚位点符合以下资料即抗体通常含有大的结合位点，能够容纳多肽底物的15-22个氨基酸，并且抗体识别远离所述切割位点的底物区。因此，所述VH区提供了控制催化部位特异性的方法。L链的分子模型表明，其Aspl、Ser27a和His93被合适地定位，用作催化三联体。通过定点诱变，用Ala残基置换Ser27a、His93或Aspl，使VIP的水解减少超过90％。一种丝氨酸蛋白酶抑制剂二异丙基氟磷酸(DFP)选择性地抑制野生型蛋白的催化活性，但该Ser27a突变体的残余活性是耐DFP的。在Ser27a、His93和Aspl上突变未影响VIP野生型L链的Km(130nM)。相反，在形成L链的延伸的活性位点的残基(Ser26、H27d/Asp28)上诱变引起Km值增加(达10倍)和周转(turnover)增加(达10倍)。这些结果可以被解释为是由于减小了基态稳定性。随之发生的ΔG+催化的降低引起周转增加。因此，已经鉴定了两种类型的参与L链催化的残基。Ser27a和His93是催化必需的，但不是与VIP基态的初始高亲合性复合必需的。Ser26和His27d/Asp28参与VIP基态结合，并间接限制周转。参阅附图说明图1。在反应的早期VIP酶L链显示突发的动力学，表明在丝氨酸蛋白酶切割肽键的过程中发生了共价酰基-L链中间体的形成。在混合所述L链和底物Pro-Phe-Arg-MCA后，监测随时间变化的荧光强度。荧光立刻增加，表示形成共价中间体，接着荧光增加较慢，表示建立了稳定速率。通过与标准氨基甲基香豆素产生的荧光相比较，根据裂解的程度计算活性位点的数目。估计催化部位的浓度为114nM，相当于用Bradford法测定的L链浓度(125nM)的大约90％。抗-VIP VL区中的催化残基(Ser27a、His93、Aspl)也存在于其种系VL区对应物中(所述种系VL基因的GenBank登录号为Z72384)。抗-VIP VL区与其种系序列相比包含4个氨基酸置换。它们是His27d:Asp、Thr28e:Ser、Ile34:Asn和Gln96:Trp。通过引入如前所述的四个所需的突变构建抗-VIP L链的种系构型蛋白。纯化的种系蛋白表达的催化活性(通过切割Pro-Phe-Arg-MCA底物测定)的水平比成熟L链低约3.5倍(330±23FU/0.4μM L链/20分钟；底物浓度50μM)。所述资料表明，起因于体细胞突变的残基的远程作用不是催化活性所必需的。本专利技术提供用于刺激产生催化性抗体及其片段的新的组合物和方法。具有对与预先确定的疾病相关的抗原特异性的催化性抗体提供了一种用于临床应用的有价值的治疗工具。本文提供的方法用于鉴定、分离和精制天然产生的用于治疗各种医学疾病和失调的催化性抗体，所述疾病包括但不限于传染病、自身免疫病和肿瘤疾病。这种催化性抗体也将用于兽医学、工业和临床研究和皮肤病学领域。本专利技术的共价反应性抗原类似物(CRAA)包含三种基本元件，并具有下式X1-Y-E-X2。E是用来与某些氨基酸的亲核性侧链共价反应的亲电子反应中心；Y是在P1位(在所述反应中心的N端侧的第一个氨基酸)的碱性残基(Arg或Lys)；而X1和X2包含三至十个在所述反应中心的N端侧和C端侧的侧翼氨基酸。产生的CRAA代表单个结构元件的新组合，所述元件协同起作用，以(a)化学结合由某些丝氨酸蛋白酶类型的催化性抗体的种系基因编码的反应性丝氨酸残基(以及可能通过种系基因的体细胞序列的多样化获得其化学反应性的诸如Thr和Cys的残基)；(b)使用离子配对和非共价力结合诸如带正电荷的Asp/Glu残基的结构，所述结构负责种系编码的催化部位的碱性残基切割特异性；和(c)通过离子配对和非共价力在多个氨基酸上结合抗体结合部位。在本专利技术的一个方面，将CRAA给予患病的活生物，CRAA籍此刺激产生特异性的催化性抗体。然后纯化所述催化性抗体。接着将如此纯化的抗体以足以使与预先确定的医学疾病相关的抗原失活的量给予需要这种治疗的患者。按照本专利技术的另一方面，公开了将免疫原性量的CRAA和免疫原性量的常规过渡态类似物(TSA)联合给予、以进一步刺激催化性抗体产生的方法和组合物。按照本专利技术的另一方面，提供了一种治疗与内源表达的催化性抗体的存在有关的病理学病症的方法。这种异常的病理学病症的实例是某些自身免疫病以及淋巴组织增生疾病。所述方法包括给予患有这种病理学病症的患者一种药用制剂，该制剂包含能够不可逆地结合内源产生的催化性抗体的共价反应性抗原类似物，其给予量足以抑制所述抗体的活性，从而缓解所述病症。在此实施方案中，所述CRAA只包含一个使CRAA免疫原性最小化的最小的B表位。按照本专利技术的另一方面，提供了一种治疗与内源产生的催化性抗体存在有关的病症的药用制剂。该药用制剂包本文档来自技高网...
【技术保护点】
包含以下结构式的共价反应性抗原类似物（ＣＲＡＡ）：Ｘ１－Ｙ－Ｅ－Ｘ２其中Ｘ１和Ｘ２是疾病相关蛋白的一个表位的肽序列；Ｙ是一个带正电荷的氨基酸残基，而Ｅ是一个亲电子反应中心。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：S保尔，G戈洛洛波夫，L史密斯，
申请(专利权)人：内布拉斯卡大学评议会，拉里J史密斯，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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