一种评估肿瘤负荷变化的方法和系统技术方案

本发明专利技术公开了一种评估肿瘤负荷变化的方法和系统。本发明专利技术的方法可以准确、灵活地评估肿瘤负荷，并同时提供肿瘤细胞的分子生物学特征。本发明专利技术的方法采用的检测样品为多个时间节点的游离DNA样本，通过游离DNA变异的检测，以变异的频率计算分子肿瘤负荷指数，并比较多个时间节点中分子肿瘤负荷指数的变化趋势，用以反映肿瘤负荷的变化趋势。

Method and system for assessing changes in tumor load

The invention discloses a method and a system for evaluating tumor load variation. The method of the invention can accurately and flexibly evaluate tumor burden, and simultaneously provide the molecular biological characteristics of tumor cells. Samples by the method of the invention for multiple time node free DNA sample, through the detection of free DNA mutation, mutation frequency to calculate molecular tumor load index, and the change trend of comparative molecular multiple time node tumor load index, to reflect the change trend of tumor burden.

【技术实现步骤摘要】
一种评估肿瘤负荷变化的方法和系统
本专利技术属于生物
，更具体而言本专利技术涉及评估肿瘤负荷的方法和系统。
技术介绍
肿瘤负荷，是指肿瘤细胞个数、肿瘤大小或体内肿瘤病灶个数，通常被用来表示肿瘤对人体的危害程度。准确评估肿瘤负荷的变化，是评估肿瘤药物临床疗效的关键。目前，临床上通常采用影像学的方法对晚期肿瘤负荷进行评估。该方法的实施需按照RECIST1.1标准(EisenhauerEA,TherasseP,BogaertsJ,etal.Newresponseevaluationcriteriainsolidtumours:revisedRECISTguideline(version1.1).Europeanjournalofcancer,2009,45(2):228-247)，根据肿瘤患者在治疗过程中影像学观察到的目标病灶的变化，将疗效和肿瘤负荷评价标准定义为：(1)完全缓解(CR)：所有靶病灶完全消失，全部病理淋巴结(包括靶结节和非靶结节)短直径减小至<10毫米；(2)部分缓解(PR)：靶病灶直径之和比基线水平(治疗前)减少至少30％；(3)疾病进展(PD)：以整个研究过程中所有测量的靶病灶直径之和的最小值为参照，直径和相对增加至少20％(如果基线测量值最小就以基线值为参照)；除此之外，必须满足直径的绝对值增加至少5毫米(出现一个或多个新病灶也视为疾病进展)；(4)疾病稳定(SD)：靶病灶减小的程度没达到PR，增加的程度也没达到PD水平，介于两者之间，研究时可以以直径之和的最小值作为参考。影像学的方法具有以下三个方面的问题(SharmaMR,MaitlandML,RatainMJ.RECIST:nolongerthesharpesttoolintheoncologyclinicaltrialstoolbox—point.Cancerresearch,2012,72(20):5145-5149；TieJ,KindeI,WangY,etal.CirculatingtumorDNAasanearlymarkeroftherapeuticresponseinpatientswithmetastaticcolorectalcancer.AnnalsofOncology.2015；26(8):1715-1722)：(1)该方法主要采用影像学评估肿瘤外部形态大小，缺乏对肿瘤细胞内部生物学活性的准确评估；(2)该方法对不可测量的病灶，如胸腔积液、腹腔积液等，缺少客观的评估体系；(3)该方法进行临床评估采用的时间节点通常固定为治疗过程中的6-8周，或治疗后每3-4个月，缺乏评估时间节点的灵活性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种全新的评估晚期患者肿瘤负荷的方法，可以准确、灵活地评估肿瘤负荷，并同时提供肿瘤细胞的分子生物学特征。本专利技术的计算分子肿瘤负荷指数(mTBI，moleculartumorburdenindex)的方法采用的检测样品为多个时间节点的游离DNA样本，通过游离DNA变异的检测，以变异的频率计算分子肿瘤负荷指数，并比较多个时间节点的分子肿瘤负荷指数的变化趋势，用以反映肿瘤负荷的变化趋势。因此，在第一方面，本专利技术提供了一种评估肿瘤负荷的变化的方法，所述方法包括步骤：1)对多个时间节点的游离DNA样本分别进行测序，获得测序读段(reads)；2)对于每个时间节点的游离DNA样本：a)得到该时间节点的游离DNA样本中检出的变异(所述变异选自SNV、InDel和SV)及其位点的CNV，并获得所述多个时间节点的游离DNA样本中检出的全部变异(所述变异选自SNV、InDel和SV)及其位点的CNV；b)统计每个所述变异的等位基因频率；c)对每个所述变异的等位基因频率用所述变异位点的CNV进行校正；d)对所述变异进行聚类，获得变异簇；e)计算每个所述变异簇中所有变异的平均等位基因频率，得到具有最大平均等位基因频率的变异簇，该最大平均等位基因频率即为该时间节点的游离DNA样本的分子肿瘤负荷指数mTBI；3)对所述多个时间节点的游离DNA样本的分子肿瘤负荷指数mTBI进行比较，反映肿瘤负荷的变化趋势。在一个实施方案中，所述方法还包括步骤：4)对患者治疗疗效或者肿瘤负荷变化进行评估，将第一时间节点的游离DNA样本的mTBI的值作为基线mTBI0，对其他时间节点j的游离DNA样本的分子肿瘤负荷指数mTBIj的值进行标准化mTBIj’，对于所述患者治疗疗效或者肿瘤负荷变化，包括：a)部分缓解(mPR)：相对于治疗前的mTBI’，被评估时间点的mTBI’降低≥25％；b)疾病进展(mPD)：与治疗过程中出现的最小mTBI’相比，所评估时间节点的mTBI’相对增加值≥25％，并且绝对增加值＞1％；c)疾病稳定(mSD)：mTBI’的降低没有达到a)中的部分缓解标准，升高也没有达到b)中的疾病进展的标准。在一个实施方案中，本专利技术的方法的步骤1)中利用捕获探针捕获游离DNA，然后对捕获的游离DNA片段进行测序。例如，捕获探针设计：基于TCGA、ICGC、COSMIC等数据库和相关文献参考，参考常规芯片捕获探针设计原则，确定芯片捕获区间；检索已报道的实体肿瘤(例如肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、宫颈癌、食管癌以及肝癌等)，将高频发生的基因的所有外显子全部设计进入捕获探针芯片。在优选的实施方案中，也可以仅基于单一或者某几种肿瘤的捕获探针芯片设计；或者仅考虑热点位置的捕获探针芯片设计。在一个实施方案中，本专利技术的方法的步骤1)中的游离DNA样本类型可以是血液(血浆)、唾液、胸腹腔积液、尿液、粪便等。在一个实施方案中，本专利技术的方法的步骤2)的a)中的测序获得测序读段(reads)采用BWA软件比对到参考基因组，得到每个游离DNA样本中检出的变异。在一个实施方案中，本专利技术的方法的步骤2)的a)中，用Mutect软件进行体细胞SNV变异(单核苷酸变异)检出；用GATK软件进行体细胞InDel(短的插入缺失)变异检出；用CONTRA软件CNV变异(拷贝数变异)检出；用ForestSV软件进行SV变异(结构变异)检出；所使用的筛选参数为：normal变异率≤2％；变异测序读段数≥5；p值≤0.05。在一个实施方案中，本专利技术的方法的步骤2)的a)中，采用ANNOVAR软件对检出变异进行注释，注释内容包括碱基突变、氨基酸突变、突变功能等。在一个实施方案中，本专利技术的方法的步骤2)的b)中，测序读段的支持结果和频率信息的统计过程采用SAMtoolsmpileup进行，参数设置为：比对质量＝30，碱基质量＝30，最少测序读段支持为4。在一个实施方案中，本专利技术的方法的步骤2)的b)中，根据步骤1)中的测序结果，获得变异V(变异V选自SNV、InDel和SV)(Vi,i＝1,…,n)的参考等位测序深度(Ri)、变异等位测序深度(Mi)，并计算变异等位基因频率(VariantAlleleFraction，VAFi)，其中，参考等位测序深度(Ri)是测序结果中在相应位点未发生该变异的正常序列的条数；变异等位测序深度(Mi)是测序结果中在相应位点发生该变异的变异序列的条数。在一个实施方案中，本专利技术的方法的步骤2)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种评估肿瘤负荷的变化的方法，所述方法包括步骤：1)对多个时间节点的游离DNA样本分别进行测序，获得测序读段；2)对于每个时间节点的游离DNA样本：a)得到该时间节点的游离DNA样本中检出的变异(所述变异选自SNV、InDel和SV)及其位点的CNV，并获得所述多个时间节点的游离DNA样本中检出的全部变异(所述变异选自SNV、InDel和SV)及其位点的CNV；b)统计每个所述变异的等位基因频率；c)对每个所述变异的等位基因频率用所述变异位点的CNV进行校正；d)对所述变异进行聚类，获得变异簇；e)计算每个所述变异簇中所有变异的平均等位基因频率，得到具有最大平均等位基因频率的变异簇，该最大平均等位基因频率即为该时间节点的游离DNA样本的分子肿瘤负荷指数mTBI；3)对所述多个时间节点的游离DNA样本的分子肿瘤负荷指数mTBI进行比较，反映肿瘤负荷的变化趋势。

【技术特征摘要】
1.一种评估肿瘤负荷的变化的方法，所述方法包括步骤：1)对多个时间节点的游离DNA样本分别进行测序，获得测序读段；2)对于每个时间节点的游离DNA样本：a)得到该时间节点的游离DNA样本中检出的变异(所述变异选自SNV、InDel和SV)及其位点的CNV，并获得所述多个时间节点的游离DNA样本中检出的全部变异(所述变异选自SNV、InDel和SV)及其位点的CNV；b)统计每个所述变异的等位基因频率；c)对每个所述变异的等位基因频率用所述变异位点的CNV进行校正；d)对所述变异进行聚类，获得变异簇；e)计算每个所述变异簇中所有变异的平均等位基因频率，得到具有最大平均等位基因频率的变异簇，该最大平均等位基因频率即为该时间节点的游离DNA样本的分子肿瘤负荷指数mTBI；3)对所述多个时间节点的游离DNA样本的分子肿瘤负荷指数mTBI进行比较，反映肿瘤负荷的变化趋势。2.根据权利要求1的方法，所述方法还包括步骤：4)对患者治疗疗效或者肿瘤负荷变化进行评估，将第一时间节点的游离DNA样本的mTBI的值作为基线mTBI0，对其他时间节点j的游离DNA样本的分子肿瘤负荷指数mTBIj的值进行标准化mTBIj’，所述患者治疗疗效或者肿瘤负荷变化包括：a)部分缓解：相对于治疗前的mTBI’，被评估时间点的mTBI’降低，例如降低≥25％；b)疾病进展：与治疗过程中出现的最小mTBI’相比，所评估时间节点的mTBI’相对增加，例如增加值≥25％，且绝对增加，例如增加值＞1％；c)疾病稳定：mTBI’的降低没有达到a)中的部分缓解标准，升高也没有达到b)中的疾病进展的标准。3.根据权利要求1或2的方法，所述步骤2)的b)中，根据步骤1)中的测序结果，获得变异Vi,＝1,…,的参考等位测序深度Ri、变异等位测序深度Mi，并计算变异等位基因频率VAFi，其中，参考等位测序深度Ri是测序结果中在相应位点未发生该变异的正常序列的条数；变异等位测序深度Mi是测序结果中在相应位点发生该变异的变异序列的条数。4.根据权利要求1或2的方法，所述步骤2)的c)中，利用变异Vi所在区域的CNVi,＝1,…,，计算变异Vi所在区域的参考拷贝数rCNi和实际总拷贝数CNi，如果在1)中使用精确的CNV检测方法(如使用SNP芯片检测)，对于不在男性性染色体上的变异，会得到两条染色体上的等位特异的拷贝数变异CNVi,major和CNVi,minor信息，其中CNVi,major≥CNVi,minor，从而获取实际的等位特异的拷贝数CNi,major和CNi,minor，5.根据权利要求1或2的方法，所述步骤2)的d)中，变异Vi,＝1,…,的参考和变异等位深度数据Ri和Mi与CTF和CNV一块评估变异肿瘤细胞比例。6.根据权利要求1或2的方法，所述步骤2)的e)中，通过预测的变异细胞比例，对变异进行聚类，例如采用PyClone软件。7.一种评估肿瘤负荷的变化的系统，所述系统包括：1)用于高通量测序多个时间点的游离DNA样本的模...

【专利技术属性】
技术研发人员：管彦芳，常连鹏，刘涛，吴爱伟，李盼松，易鑫，杨玲，
申请(专利权)人：北京吉因加科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11