一种新型哮喘多肽疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种新型多肽哮喘疫苗及其制备方法。本发明专利技术要解决的技术问题是为本领域的哮喘治疗提供一种新的有效选择。本发明专利技术解决技术问题的技术方案为在E3多肽的氮端连接DiTOX多肽或者PADRE多肽得到新的融合多肽，该多肽能够作为主要活性成分制备成哮喘疫苗。本发明专利技术的多肽疫苗可以有效的诱导特异性的体液免疫，可以打破免疫耐受，在作为哮喘治疗性多肽疫苗方面具有很好的应用前景。

Novel asthma polypeptide vaccine and preparation method thereof

The invention belongs to the field of biological medicine, in particular to a novel polypeptide asthma vaccine and a preparation method thereof. The technical problem to be solved is to provide a new and effective choice for the treatment of asthma in the field. The technical scheme for solving the technical problem of the invention is that a new fusion polypeptide is obtained by connecting DiTOX polypeptide or PADRE polypeptide at the nitrogen end of the E3 polypeptide, which can be used as the main active component to prepare an asthma vaccine. The polypeptide vaccine of the invention can effectively induce specific humoral immunity, can break the immune tolerance, and has a good application prospect in the treatment of asthma therapeutic polypeptide vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种新型哮喘多肽疫苗及其制备方法
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种新型哮喘多肽疫苗及其制备方法。
技术介绍
据世界卫生组织统计，目前全球有约三亿人正罹患哮喘。哮喘是儿童中的最常见非传染性疾病。哮喘不仅仅是高收入国家的公共卫生问题，它发生在所有国家，无论发展水平高低。大多数与哮喘有关的死亡发生在低收入和中低收入国家。支气管哮喘(Bronchialasthma，简称哮喘)是一种主要的非传染性疾病，以呼吸困难和喘息反复发作为特征，它是由多种细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。这种慢性炎症与气道高反应性相关，通常出现广泛多变的可逆性气流受限，并引起反复发作性的喘息、气急、胸闷或咳嗽等症状，常在夜间和(或)清晨发作、加剧，多数患者可自行缓解或经治疗缓解。支气管哮喘如诊治不及时，随病程的延长可产生气道不可逆性缩窄和气道重塑。目前，哮喘的相关基因尚未完全明确，但有研究表明存在有与气道高反应性、IgE调节和特应性反应相关的基因，这些基因在哮喘的发病中起着重要作用。环境因素中主要包括某些激发因素，如尘螨、花粉、真菌、动物毛屑、二氧化硫、氨气等各种特异和非特异性吸入物；感染，如细菌、病毒、原虫、寄生虫等；食物，如鱼、虾、蟹、蛋类、牛奶等；药物，如普萘洛尔(心得安)、阿司匹林等；气候变化、运动、妊娠等都可能是哮喘的激发因素。IL-13是由Th2细胞产生的具有调节炎症和免疫应答的多功能细胞因子，通过激活嗜酸性粒细胞，减少其凋亡，促进B细胞的生成和细胞因子IgE的分泌等，它参与哮喘等多种变态反应性疾病的发生，也与多种黏附分子及趋化因子表达增多、支气管杯状细胞分泌黏液增多和气道上皮下纤维化有关。因此，抑制IL-13的功能已经成为哮喘治疗的理想靶点。目前，已经有IL-13的单克隆抗体及可溶性IL-13受体进入了临床Ⅱ、Ⅲ期，但是还并没有出现IL-13多肽相关疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型治疗哮喘多肽疫苗及其制备方法，为本领域的哮喘治疗提供一种新的有效选择。为了解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案是提供一种融合多肽，该融合多肽是由IL-13来源的多肽片段E3和辅助性T细胞抗原多肽片段连接而成。本专利技术融合多肽是在E3多肽的氮端连接DiTOX多肽或者PADRE多肽而成；所述的E3多肽的氨基酸序列为LTLKELIEELSNITQ；所述的DiTOX多肽的氨基酸序列为AYNFVESIINLFQVVHNSY；所述的PADRE多肽的氨基酸序列为aK-Cha-VAaWTLKAa。其中，上述的多肽的氨基酸序列为：AYNFVESIINLFQVVHNSYNLTLKELIEELSNITQ；或为aK-Cha-VAaWTLKAaLTLKELIEELSNITQ。其中的a表示D-丙氨酸；-Cha-表示L-环己基丙氨酸。其中，上述融合多肽的N端氨基被或者乙酰化。其中，上述融合多肽的C端羧基被酰胺化。进一步的，上述融合多肽的氨基酸序列为：Ac-AYNFVESIINLFQVVHNSYNLTLKELIEELSNITQ-NH2；或为Ac-aK-Cha-VAaWTLKAaLTLKELIEELSNITQ-NH2。其中Ac-表示所连氨基酸的氨基被乙酰化；-NH2表示所连氨基酸的羧基被酰胺化；a表示D-丙氨酸；-Cha-表示L-环己基丙氨酸；本专利技术还提供了上述的多肽在制备哮喘疫苗中的用途。本专利技术也提供了一种哮喘疫苗。该哮喘疫苗是以上述的多肽为主要活性成分制备而成。其中，上述的哮喘疫苗还含有佐剂。其中，上述的哮喘疫苗中所述的佐剂为氢氧化铝佐剂、阳离子脂质体佐剂、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、γ-干扰素中的至少一种。此外本专利技术还提供了制备上述的融合多肽的方法以及制备权利上述的哮喘疫苗的方法。本专利技术的有益效果在于：本专利技术融合多肽分子量小，合成方便，可以方便的使用Fmoc固相多肽合成法合成，还可以加入佐剂，如氢氧化铝，阳离子脂质体，GM-CSF，γ-干扰素等制成各种临床适用的疫苗剂型；而更重要的是本专利技术的多肽疫苗可以有效的诱导特异性的体液免疫，可以打破免疫耐受，对哮喘动物模型中有非常优秀的疗效，在制备哮喘治疗性多肽疫苗方面具有很好的应用前景。附图说明图1、三种IL-13抗原短肽相关融合多肽进行动物免疫后的小鼠血清抗体滴度趋势图。图2、四种融合多肽治疗哮喘的动物免疫后小鼠血清抗体滴度趋势图。图3、四种融合多肽治疗哮喘的动物免疫实验肺泡灌洗液(BALF)细胞计数结果。图4、四种融合多肽治疗哮喘的动物免疫实验的相关细胞因子检测结果图。图5、四种治疗哮喘多肽的动物免疫实验OVA特异的抗体滴度的检测结果图。图6：四种治疗哮喘多肽的动物免疫实验病理学分析结果图。具体实施方式本专利技术融合多肽是由IL-13来源的多肽片段E3和辅助性T细胞抗原多肽片段连接而成。具体而言，本专利技术是在E3多肽的氮端连接DiTOX多肽或者PADRE多肽得到了一种新的融合多肽。所述的E3多肽的氨基酸序列为LTLKELIEELSNITQ；所述的DiTOX多肽的氨基酸序列为AYNFVESIINLFQVVHNSY；所述的PADRE多肽的氨基酸序列为aK-Cha-VAaWTLKAa。其中，上述融合多肽的氨基被或者乙酰化。羧基被乙酰化为可以增加多肽稳定性。其中，上述融合多肽的C端羧基被酰胺化。羧基被酰胺化为可增加多肽稳定性。进一步的，上述融合多肽的氨基酸序列为：Ac-AYNFVESIINLFQVVHNSYNLTLKELIEELSNITQ-NH2；或者为Ac-aK-Cha-VAaWTLKAaLTLKELIEELSNITQ-NH2。其中Ac-表示所连氨基酸的氨基被乙酰化；-NH2表示所连氨基酸的羧基被酰胺化；a表示D-丙氨酸；-Cha-表示L-环己基丙氨酸；本专利技术还提供了上述的多肽在制备哮喘疫苗中的用途。本专利技术也提供了一种哮喘疫苗。该哮喘疫苗是以上述的多肽为主要活性成分制备而成。其中，上述的哮喘疫苗还含有佐剂。其中，上述的哮喘疫苗中所述的佐剂为氢氧化铝佐剂、阳离子脂质体佐剂、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、γ-干扰素中的至少一种。上述的多肽疫苗的使用途径包括但不限于肌肉注射、皮下注射、皮内注射、静脉注射和鼻粘膜滴注等。即上述多肽疫苗的剂型可为注射剂、滴注剂或喷雾剂。进一步的，所述的注射剂为肌肉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂或静脉注射剂中的任一种。当然，所述的注射剂可以为冻干剂或者注射液。此外本专利技术还提供了制备上述的融合多肽的方法以及制备权利上述的哮喘疫苗的方法。本专利技术中的多肽可以用人工合成等方法制得。其中一种可以选用的方法为Fmoc固相多肽合成法，该方法包括如下步骤：1)以氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将一个氨基被封闭基团Fmoc-保护的氨基酸，加入适量的缩合剂、催化剂和碱，将氨基酸共价连接到固相载体上，再以10～50％的哌啶溶液脱去氨基的封闭基团，这样第一个氨基酸即连接到固相载体上。2)另一个氨基被封闭基团Fmoc-保护的氨基酸，加入适量的缩合剂、催化剂和碱，将氨基酸共价连接到已经连接了氨基酸的固相载体上，再以10～50％的哌啶溶液脱去氨基的封闭基团，这样在固相载体上就连接了一个二肽。3)重复上述本文档来自技高网...

【技术保护点】
融合多肽，其特征在于：在E3多肽的氮端连接DiTOX多肽或者PADRE多肽而成；所述的E3多肽的氨基酸序列为LTLKELIEELSNITQ；所述的DiTOX多肽的氨基酸序列为AYNFVESIINLFQVVHNSY；所述的PADRE多肽的氨基酸序列为aK‑Cha‑VAaWTLKAa。

【技术特征摘要】
1.融合多肽，其特征在于：在E3多肽的氮端连接DiTOX多肽或者PADRE多肽而成；所述的E3多肽的氨基酸序列为LTLKELIEELSNITQ；所述的DiTOX多肽的氨基酸序列为AYNFVESIINLFQVVHNSY；所述的PADRE多肽的氨基酸序列为aK-Cha-VAaWTLKAa。2.根据权利要求1所述的融合多肽，其特征在于：所述的多肽的氨基酸序列为：AYNFVESIINLFQVVHNSYNLTLKELIEELSNITQ；或为aK-Cha-VAaWTLKAaLTLKELIEELSNITQ。3.根据权利要求1或2所述的融合多肽，其特征在于：所述的多肽的N端氨基被乙酰化。4.根据权利要求1或2所述的融合多肽，其特征在于：所述的多肽的C端羧基被酰胺化。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨莉，何谷，万洋，魏于全，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51