一种抗人CRP抗体及其应用制造技术

本申请涉及抗人C‑反应蛋白(CRP)抗体及其制备方法以及上述抗体在人C‑反应蛋白检测中的应用。本申请发明专利技术人制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的抗体组合(P20及P02)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能均可满足人临床样本检测的人C‑反应蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡。

Anti human CRP antibody and application thereof

The invention relates to an anti human C C-reactive protein (CRP) antibody and its preparation method and application of the antibody in the detection of C reactive protein in. A variety of the antibodies to the application inventor system, and pair selection, to obtain the sensitivity and specificity are able to meet the demand of the combination of antibodies (P20 and P02); at the same time it is convenient for mass production, which can meet the needs of large-scale clinical application after. Work on the combination of antibody detection system debugging and optimization, to obtain simple, sensitivity, specificity and detection performance can meet the gold immunochromatographic assay for quantitative detection of human C protein reaction clinical samples detection card.

【技术实现步骤摘要】
一种抗人CRP抗体及其应用
本专利技术属于生物
，具体的涉及两种抗人C-反应蛋白(CRP)抗体及其制备方法以及上述抗体在人C-反应蛋白检测中的应用。
技术介绍
C-反应蛋白(Creactiveprotein，CRP)是蛋白质家族中的一员，是一种急性期反应蛋白，在组织损伤和细菌感染时血浆浓度急剧升高，是机体重要的防御分子，主要由肝脏产生并分泌。CRP由五个完全相同的球形单体以非共价键结合组成稳定的盘状结构，属于正五聚体家族。CRP在结构上为对称的五面体，其单体由206个氨基酸组成，分子量约为23KDa，CRP的总分子量约为118KDa。CRP参与体内的各种炎症及免疫反应，是冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)的重要标志物。大量研究表明：高水平的CRP是周围性血管病、心肌梗死、脑血管病及血管性死亡的独立风险预测因子。在正常人血清中CRP含量极少，浓度为0.062-8.2mg/L，半衰期约为15小时。当发生细菌感染2小时后即开始升高，平均8小时增加1倍，48小时达高峰，其在病毒感染时则不会升高。CRP持续升高则提示机体存在慢性炎症或自身免疫性疾病。CRP变化不受病人的个体差异、机体状态及治疗药物的影响。另外，CRP在其他领域亦发挥着重要的作用：①在由慢性炎症引发心血管疾病的独立危险因素中CRP的作用已被证实，及时监测CRP的水平变化对心血管疾病的干预及预后起重要作用。有些学者甚至认为CRP可作为心血管危险评估的金标准，且CRP水平越高，发生心脑血管的危险性就越大；②CRP可用来评价急性胰腺炎的严重程度，当发生广泛坏死性胰腺炎时血清中CRP的水平可高达250mg/L；③如将CRP与甲胎蛋白联合应用，可用来鉴别肝脏恶性肿瘤与良性疾病，为临床治疗方案制定提供指导；另外，CRP测定对肿瘤的治疗和预后亦有积极的意义，恶性肿瘤患者CRP水平大都升高，手术切除肿瘤后CRP水平则会下降，且进行放疗、化疗和皮质激素治疗对血清CRP的影响非常小，所以测定血清CRP的水平变化有助于临床估测各个器官系统中恶性肿瘤的进展过程。④评估患者预后：CRP水平越高，提示疾病控制不佳，预后不良。鉴于CRP在众多领域中的重要作用，制备CRP抗体并用于制备CRP定量检测试剂盒具有重要的临床应用价值。CRP通常是通过抗体浊度法或免疫比浊法测定的，而他们的检测能力在3-5mg/L以上，这个水平仅仅适用于对感染的预测，而对于冠脉及脑血管的危险预测是远远不够的。除上述技术以外，使用胶体金和荧光定量检测技术的CRP试纸卡，可满足快速检测及床旁检测的需求。其中基于胶体金定量层析技术的全程CRP检测方法既具有全自动生化仪免疫透射比浊法试剂的准确性，同时检测更加简便、快速，适合床旁诊断，易于在门诊、急诊或者ICU病房内开展。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供能有效的、特异性结合人C-反应蛋白的抗体。更具体地说：本专利技术的第一目的在于提供两种抗人C-反应蛋白抗体。第一种抗人C-反应蛋白抗体(P20)，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：1所示的HCDR1、如序列SEQIDNO：2所示的HCDR2和/或如序列SEQIDNO：3所示的HCDR3；其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：4所示的LCDR1、如序列SEQIDNO：5所示的LCDR2和/或如序列SEQIDNO：6所示的LCDR3。优选的是本专利技术中的抗体P20的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。第二种抗人C-反应蛋白抗体(P02)，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：9所示的HCDR1、如序列SEQIDNO：10所示的HCDR2和/或如序列SEQIDNO：11所示的HCDR3；其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：12所示的LCDR1、如序列SEQIDNO：13所示的LCDR2和/或如序列SEQIDNO：14所示的LCDR3。优选的是本专利技术中抗体P02的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示，抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:16所示。本专利技术第二个目的是提供两种单链抗体，所述单链抗体P20的氨基酸序列如SEQIDNO:17所示；所述单链抗体P02的氨基酸序列如SEQIDNO:18所示。本专利技术第三个目的是提供两种编码上述单链抗体的核苷酸序列，编码单链抗体P20的核苷酸序列如SEQIDNO:19所示，和编码单链抗体P02的核苷酸序列如SEQIDNO:20所示。本专利技术第四个目的是提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。本专利技术第五个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主细胞。所属宿主细胞可以是大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞，优选为大肠杆菌。本专利技术第六个目的是提供一种生产上述单链抗体的方法，包括：1)在合适的条件下培养上述重组宿主菌表达抗体；2)然后从宿主菌中纯化、收集抗体。本专利技术的第七个目的在于提供上述抗人C-反应蛋白抗体在检测人C-反应蛋白含量中的应用。本专利技术的第八个目的在于提供一组可进行配对并检测人C-反应蛋白的抗体对组合P20和P02；该抗体对组合的检测灵敏度高，特异性好。本专利技术的第九个目的在于提供一种利用所述抗人C-反应蛋白抗体检测人C-反应蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡，包括样品吸收垫、金标垫、反应膜和吸水垫；所述金标垫喷涂有胶体金颗粒标记的抗体P02或P20，所述反应膜上有检测带和质控带，检测带位置包被有抗体P20或P02，质控带位置包被抗His标签抗体或ProteinL。所述反应膜优选硝酸纤维素膜。所述抗His标签抗体优选鼠抗His抗体。本专利技术制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的抗体组合(P20及P02)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能均可满足人临床样本检测的人C-反应蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡。附图说明图1：PCR鉴定P20和P02抗体重链及轻链可变区琼脂糖凝胶电泳图。其中，Lane1为200bpDNALadder；Lane2为抗体P20重链可变区DNA序列；Lane3为抗体P20轻链可变区DNA序列；Lane4为抗体P02重链可变区DNA序列；Lane5为抗体P02轻链可变区DNA序列。图2：单链抗体结构示意图。VH表示重链可变区序列，VL表示轻链可变区序列，His标签为六个组氨酸。图3：单链抗体P20和P02在重组大肠杆菌工程菌中的诱导表达鉴定图。其中，图3-a为单链抗体P20和P02在重组大肠杆菌工程菌中的诱导表达SDS-PAGE凝胶电泳图。泳道1为(10-230kDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker；泳道2为未加入IPTG诱导的单链抗体P20重组大肠杆菌工程菌裂解液；泳道3为加入IPTG诱导的单链抗体P20重组大肠杆菌工程菌裂解液；泳道4为未加入IPTG诱导的单链抗体P02重组大肠杆菌工程菌裂解液；泳道5为加入IPTG诱导的单链抗体P02重组大肠杆菌工程菌裂解液。图3-b为单链抗体P20和P02在重组大肠杆菌工程菌中的诱导表达蛋白免疫印迹本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗人C‑反应蛋白抗体，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

【技术特征摘要】
1.抗人C-反应蛋白抗体，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：1所示的HCDR1、如序列SEQIDNO：2所示的HCDR2和/或如序列SEQIDNO：3所示的HCDR3；其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：4所示的LCDR1、如序列SEQIDNO：5所示的LCDR2和/或如序列SEQIDNO：6所示的LCDR3。2.权利要求1所述的抗人C-反应蛋白抗体，其特征在于重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示，轻链可变区...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，赵利利，王安良，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，常州京森生物医药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32