一种针对蛋白E2-2的单克隆抗体制造技术

本发明专利技术涉及一种针对蛋白E2-2的单克隆抗体，具体是利用原核表达系统表达E2-2(TCF4)蛋白，免疫Balb/c小鼠，利用ELISA和免疫组化方法，筛选得到一株杂交瘤细胞株，其能够产生特异性结合人E2-2蛋白的单克隆抗体。在免疫酶学检测(ELISA)、免疫印迹(Western)和免疫组化实验中，该抗体能够特异性的结合E2-2。所述单克隆抗体可以用于诊断各种pDC相关的疾病，包括Pitt-Hopkins综合征、精神分裂症、有pDC浸润的实体肿瘤、母细胞性浆样树突状细胞淋巴瘤、其它与pDC频率变化相关的疾病等。

A monoclonal antibody directed against protein E2-2

The invention relates to a monoclonal antibody against protein E2-2, specifically expressed by prokaryotic expression system E2-2 (TCF4) protein, Balb/c mice were immunized with ELISA and immunohistochemical method, screening hybridoma cell lines, which can produce specific binding of monoclonal antibodies against human E2-2 protein. In immunoassay (ELISA), Western blot (Western) and immunohistochemistry, the antibody could specifically bind E2-2. The monoclonal antibody can be used for the diagnosis of various diseases related to pDC, including Pitt-Hopkins syndrome, schizophrenia, pDC solid tumor, infiltration of blastic plasmacytoid dendritic cell lymphoma, and other diseases related to pDC frequency change.

【技术实现步骤摘要】
一种针对蛋白E2-2的单克隆抗体专利
本专利技术涉及抗体工程领域，具体涉及针对蛋白E2-2的单克隆抗体。
技术介绍
E2-2是E蛋白家族的一员，又名TCF4(Transcriptionfactor4)，从属于bHLH(basichelix-loop-helix)转录因子超家族[1]。人E2-2基因有41个外显子，在18号染色体18q21.2。作为单体E2-2没有DNA结合活性，但是和其它蛋白形成同源二聚体或异源二聚体，可以结合DNA并发挥转录活性[2]。E2-2有多个可变剪接的转录本，对应编码不同的蛋白质。Sepp等人研究人E2-2基因的可变剪接转录本调节E2-2基因结构、表达和编码潜力的作用。他们发现人E2-2在脑里表达的特别高，通过使用大量的5’端外显子可以形成不同的蛋白亚型，有18种不同的N端。他们也观察到内部外显子的可变剪接，可形成更多的转录本。功能分析显示，不同的E2-2蛋白亚型有不同的亚细胞定位：含有核定位信号(Nuclearlocalizationsignal，NLS)的蛋白亚型定位在细胞核中，其它的在细胞质中也能检测到。没有NLS的蛋白亚型可能通过结合一些含有NLS的bHLH蛋白进入细胞核。没有NLS的亚型还可能通过结合一些含有核输出信号(Nuclearexportsignal，NES)的蛋白离开细胞核，被运输到细胞质中[3]。E2-2可以和钙调蛋白结合，可能参与到Ca2+信号的调节。在体外和生理条件一致的Ca2+浓度下，E2-2和E2A蛋白碱性区域的N端序列能结合钙调蛋白，其DNA结合的活性将被抑制[4]。增加胞内Ca2+浓度或者过表达钙调蛋白，都可以抑制E2-2的转录活性。Ca2+信号可能通过形成E蛋白-钙调蛋白复合物阻止E蛋白结合目的DNA[5]。E2-2主要表达在人浆细胞样树突状细胞(pDCs)中，髓样树突状细胞(DCs)和前体细胞均不表达。在人胸腺前体细胞中过表达E2-2可刺激pDCs的发育，通过RNA干扰抑制E2-2表达可有效抑制前体细胞向pDCs发育[6]。在CD34+造血祖细胞中过表达Id2或Id3可通过抑制E蛋白活性进而抑制pDCs发育，不影响DCs发育[7]。E2-2和SpiB可以协同作用，在前体细胞中同时过表达二者可进一步刺激pDCs发育[6]。研究认为Pitt-Hopkins综合征(PHS)和E2-2单等位基因突变有关[3]。检测病人血液可以发现pDC数量减少，BDCA2基因表达下调，而且产生干扰素的能力被阻断，PHS病人持续的呼吸道感染可能就是由pDC的缺陷引起的[1,8]。另外，母细胞性浆细胞样树突状细胞淋巴瘤(BPDCN)是一种罕见的起源于浆细胞样树突状前体细胞的恶性肿瘤。BPDCN细胞表达pDCs特异性分子BDCA2、CD123、CD4、TCL1、Bcl11A、CD2AP和Spi-B[9-11]。因为BPDCN细胞表达髓系分子CD56，BPDCN曾被认为是母细胞性NK细胞淋巴瘤，直到pDCs发现以后，根据BPDCN的分子标志和部分功能，将其归为母细胞性浆细胞样树突状细胞淋巴瘤[9]。有文章报道，Spi-B可以作为BPDCN的诊断标志物[12]。在中枢神经系统里，E2-2主要表达在前脑、间脑和小脑中。E2-2对神经胶质细胞分化，尤其是少突胶质细胞前体的成熟，非常重要[13]。在出生后的脊髓中，E2-2仅表达在少突胶质细胞中，随着髓鞘形成逐渐减少。E2-2可以和一系列bHLH转录因子形成异二聚体参与神经系统发育的调节，例如ATOH1(Atonalhomolog1，别名MATH1)，在分化中的神经上皮里表达[14]；ASCL1(Achaete-scutecomplexhomolog1，小鼠中别名MASH-1，人里别名HASH-1)，对中枢神经系统特别是前脑神经元回路的形成是必须的[15]；Id1对正确进行神经元发生是必须的[16]；Olig2调节腹侧神经外胚层前体细胞命运，对少突胶质细胞和运动神经元的发育是必须的[13]；NEUROD2(别名NDRF)，对神经元分化和生存非常重要[17]。通过参与到这样一个交错联合的调节网络，E2-2对中枢神经系统的发育进行调节。E2-2突变将导致神经发育失调相关的多种疾病[18]。Pitt-Hopkins综合征是一种罕见的神经发育失调的疾病，病人的学习和记忆能力有严重缺陷，语言学习能力几乎完全缺失，表现为智力残疾，非典型性自闭和过度换气，被称为“孤儿病”。研究认为PHS和E2-2单等位基因突变有关，PHS病人仅有正常量一半的E2-2，这说明PHS对E2-2剂量很敏感。引起PHS的E2-2基因突变是非常多样的，有整个基因的删除，部分基因的删除，读码框移码(包括终止密码子提前出现)，无义突变，剪接位点突变和错义突变。目前为止，几乎所有的病例都有自己独特的E2-2基因突变，只有极少数病例的E2-2基因突变相同。错义突变一般出现在结合DNA调节元件的bHLH结构域，它是一个突变热点，约15％的PHS病例是这种情况。约40％的PHS病例是点突变导致的终止密码子提前出现[19-21]。遗传流行病学研究显示，精神分裂症是遗传的可能性高达80％[22]。基因组关联分析发现，E2-2附近两个遗传位点的变异可能有患精神分裂症的风险。检查精神病人血液中的E2-2水平，是显著减少的。剖析14个精神分裂症病人组的小脑皮质区，发现和6个对照组相比，E2-2表达是上调的。但是也有研究事后剖析比较三个脑部区域，发现E2-2的mRNA水平和精神分裂症没有关联[23]。Navarrete等人检测了106个精神分裂症病人组和96个对照组的淋巴细胞，发现病人组的E2-2mRNA水平比对照组低约20％[24]。研究显示，Pitt-Hopkins综合征、精神分裂症、有pDC浸润的实体肿瘤、母细胞性浆样树突状细胞淋巴瘤等疾病，都与pDCs相关，那么如果要鉴定这些疾病，就需要准确快速鉴定pDCs。pDCs的特异性标志物有CD123、BDCA2、Spi-B、E2-2等，CD123即可以识别pDCs，也识别血管内皮细胞；BDCA2和Spi-B虽然有组织化学抗体，但是并没有被广泛应用；而关于E2-2，目前还没有针对其的单克隆抗体。E2-2是pDCs的转录因子，蛋白表达和筛选单克隆抗体非常有难度，我们根据E2-2蛋白的特点，纯化了非全长E2-2的蛋白，利用免疫组化的方法筛选单克隆抗体。筛选得到E2-2单克隆抗体，不仅有利于基础科学的研究，而且在pDCs相关疾病中的鉴定中发挥重要作用。
技术实现思路
本专利技术涉及以下各项：1.一种针对蛋白E2-2的单克隆抗体，所述抗体通过以下步骤制备：1)重组表达E2-2或其片段；2)用所述重组表达E2-2或其片段免疫小鼠；3)将免疫后小鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合；4)筛选上清特异识别蛋白E2-2或其片段的单克隆。2.一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞分泌特异识别蛋白E2-2或其片段的单克隆抗体。3.根据第1项所述的单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞，其中，所述单克隆抗体利用E2-2片段免疫、筛选得到，所述E2-2片段由SEQIDNO：1所示核苷酸序列编码。4.一种抗人E2-2的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞保藏在中国微生物菌种保藏管理委本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针对蛋白E2‑2的单克隆抗体，所述抗体通过以下步骤制备：1)重组表达E2‑2或其片段；2)用所述重组表达E2‑2或其片段免疫小鼠；3)将免疫后小鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合；4)筛选上清特异识别蛋白E2‑2或其片段的单克隆。

【技术特征摘要】
1.一种针对蛋白E2-2的单克隆抗体，所述抗体通过以下步骤制备：1)重组表达E2-2或其片段；2)用所述重组表达E2-2或其片段免疫小鼠；3)将免疫后小鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合；4)筛选上清特异识别蛋白E2-2或其片段的单克隆。2.一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞分泌特异识别蛋白E2-2或其片段的单克隆抗体。3.根据权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞，其中，所述单克隆抗体利用E2-2片段免疫、筛选得到，所述E2-2片段由SEQIDNO：1所示核苷酸序列编码。4.一种抗人E2-2的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞保...

【专利技术属性】
技术研发人员：张立国，于海生，程梦兰，尹相云，马建平，李靖云，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11