一种人NOTCH1 NICD蛋白抗原、抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及了一种特异性针对人NOTCH1 NICD蛋白Thr1861位点磷酸化抗原肽、抗体、上述抗原肽和抗体的应用以及上述抗体的制备方法。所述抗体是通过活性氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，且其中的Thr氨基酸被磷酸化作为抗原肽免疫动物制备得到的。本发明专利技术在制备所述抗体时，利用亲和纯化‑亲和分离技术对抗血清进行纯化。所述制备方法具有制备周期短、抗体的效价高、回收率好等优势，获得的抗体具有高特异性、高亲和力，本发明专利技术提供的磷酸化抗体有助于揭示NOTCH1 NICD蛋白的磷酸化修饰在肿瘤等疾病发生发展过程中的作用机制，在肿瘤诊断、治疗及预后判定等方面具有广泛的临床应用前景。

Human NOTCH1 NICD protein antigen, antibody and preparation method and application thereof

The present invention relates to the application of a specific NOTCH1 NICD protein phosphorylation site Thr1861 antigen peptide, antibody, the antigen peptide and antibody and the antibody preparation method. The antibody is through the activity of amino acid sequence of SEQ ID NO:1 shows, and Thr which is phosphorylated amino acid peptide as antigen immune animal prepared. The invention is the preparation of the antibody in the system, using affinity purified antiserum was purified affinity purification technology. The preparation method has the advantages of short preparation period, antibody titer, recovery rate and other advantages, to obtain antibodies with high specificity, high affinity, phosphorylated antibody provided by the invention is helpful to reveal the NOTCH1 NICD protein phosphorylation in tumor occurrence and development mechanism in the process of and the broad prospects of clinical application in tumor diagnosis, treatment and prognosis.

【技术实现步骤摘要】
一种人NOTCH1NICD蛋白抗原、抗体及其制备方法和应用
本专利技术涉及抗体及其制备
，具体涉及一种特异性针对人NOTCH1NICD蛋白Thr1861位点磷酸化抗原、抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
NOTCH信号是一个在进化过程中高度保守的信号通路，广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物的多个物种之中，它是介导细胞和细胞之间直接接触的主要信号通路之一，调控了多细胞机体的细胞凋亡、增殖和分化。从果蝇到人类，NOTCH信号途径的遗传特征高度保守，而在哺乳动物中其调控过程尤为复杂。NOTCH受体、NOTCH配体和细胞内效应分子CSL共同组成NOTCH信号通路。NOTCH受体为单链跨膜蛋白，其分子由胞外区、跨膜区和胞内区(NICD)组成，具有高度保守性。目前人类中已发现4种NOTCH受体基因(NOTCH1，NOTCH2，NOTCH3，NOTCH4)，各型的主要差异在EGF样重复的数目和胞内区的长度。NOTCH配体亦为细胞表面表达的单链跨膜蛋白，已发现人的NOTCH配体有Jagged1，Jagged2，Delta1，Delta3，Delta4。人NOTCH1信号是由蛋白受体与配体相互作用导致，NOTCH1蛋白受体经3次水解，释放出胞内段蛋白(NICD)，NOTCH1NICD转入细胞核内，通过与CBF1/Su(H)/LAG1(CSL)相互作用形成复合物，使后者由转录抑制因子转化为转录激活因子，调节细胞的增殖、凋亡和分化并影响许多器官的发育和功能，其信号通路的异常改变与肿瘤、血液系统、心血管系统等多种疾病相关。研究表明：在大多数恶性肿瘤中，NOTCH1信号主要为促癌作用，活化的NOTCH1蛋白可使细胞增殖并恶性转化为肿瘤，如在宫颈癌、胃癌、肾癌及多种血液系统肿瘤中均发现NOTCH1的异常表达，但是最近发现NOTCH1在不同肿瘤和肿瘤的不同阶段中，其发挥的作用也不尽相同。例如在头颈部鳞状细胞癌中NOTCH1信号具有抑癌作用；在宫颈癌的早期，NOTCH1信号起促癌作用，晚期则起抑癌作用。此外，由于NOTCH1NICD蛋白是Wnt、TGFβ/BMP和Hedgehog等多条通路的重要交汇点，其异常可能通过对其他信号通路的影响参与肿瘤的发生、发展、转归和预后。磷酸化等翻译后修饰在NOTCH信号通路介导的生理和病理过程中发挥着关键调节作用。已有研究表明：NOTCH1NICD蛋白的磷酸化修饰是NOTCH信号通路重要的调控机制，它不仅可以促进信号的活化，更为重要的是它可以通过启动泛素化降解NOTCH1NICD从而终止信号，是NOTCH1信号通路精准调控的关键。磷酸化修饰的异常，造成NOTCH1NICD半衰期的延长将导致白血病和其它实体癌症的发生。人NOTCH1氨基酸序列中Thr1861位点位于NOTCH1NICD中，是NOTCH1蛋白磷酸化修饰的一个关键位点，在NOTCH1信号的活化或降解失活的动态调控中发挥着重要的作用。抗体是蛋白质功能研究的重要工具，已被广泛用于肿瘤等疾病诊断、治疗等临床应用中，磷酸化抗体的制备和应用已成为国际上生命科学发展的热点，在疾病的机制研究、诊断和治疗靶点的发现中发挥重要的作用。
技术实现思路
本专利技术在于解决在调控NOTCH1信号通路中发挥重要作用的NICD蛋白的磷酸化修饰，为此，本专利技术的目的之一是提供一种特异性针对人NOTCH1NICD蛋白Thr1861位点磷酸化抗原肽。本专利技术的另一目的是提供一种特异性针对人NOTCH1NICD蛋白Thr1861位点磷酸化抗体。本专利技术的另一目的是提供上述抗原肽和抗体的应用。本专利技术的另一目的是提供上述抗体的制备方法。实现上述目的的技术方案如下。一种人NOTCH1NICD蛋白的抗原肽，其活性氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，且其中的Thr氨基酸被磷酸化。在其中一个实施例中，上述人NOTCH1NICD蛋白的抗原肽的C末端连接有一个半胱氨酸。一种人NOTCH1NICD蛋白的抗体，其是通过上述人NOTCH1NICD蛋白的抗原肽免疫动物制备得到的。上述的人NOTCH1NICD蛋白的抗原肽和/或抗体在制备用于肿瘤等疾病的诊断、治疗、预后判定的药物或试剂中的应用。一种用于肿瘤的诊断、治疗、预后判定的药物或试剂，其包括有上述的人NOTCH1NICD蛋白的抗原肽和/或抗体。所述肿瘤为与人NOTCH1信号通路相关的肿瘤，例如宫颈癌、胃癌、口腔癌、肾癌及多种血液系统肿瘤。上述人NOTCH1NICD蛋白的抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)得到活性氨基酸为如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的抗原肽，氨基酸Thr上添加有磷酸化基团且C末端连接有一个半胱氨酸；(2)利用步骤(1)合成的抗原肽与载体蛋白血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)进行偶联，免疫动物并收集抗血清；(3)将步骤(2)收集的抗血清进行纯化和鉴定，获得人NOTCH1NICD蛋白Thr1861位点磷酸化的抗体。上述步骤(2)中所述的免疫动物的步骤可以包括：用上述步骤(1)合成的抗原肽偶联血蓝蛋白与佐剂联合免疫新西兰大白兔；免疫方式为经颈部、背部皮肤较薄、松弛的部位两侧皮下注射，臀肌与大腿部两侧分别肌肉注射，腰部两侧皮内注射，爪垫注射等多部位多点注射；免疫次数包括1次引发注射，3～4次加强注射和最后一次采用抗原直接注射。上述步骤(3)中所述的纯化和鉴定的步骤可以包括：将上述步骤(2)收集的抗血清以ELISA实验测定抗血清针对上述抗原肽的效价，利用亲和纯化-亲和分离技术(先亲和纯化，然后再亲和分离)对抗血清进行纯化。可以以Dotblot实验确定纯化后的抗体是否能够特异性识别磷酸化NOTCH1NICD蛋白。上述利用亲和纯化-亲和分离技术对抗血清进行纯化的步骤可以包括：首先采用磷酸化合成肽(抗原肽)偶联蛋白与琼脂糖进行偶联作为层析填料进行亲和纯化，获取针对磷酸化抗原表位的所有抗体并通过改变pH和离子浓度除去低亲和力的低序列复杂性表位抗体；接着使用非磷酸化合成肽偶联载体蛋白与琼脂糖进行偶联作为层析填料进行亲和分离，除去磷酸化抗体中非特异性结合的非磷酸化表位抗体。本专利技术筛选并制备获得的高特异性、高亲和力的人NOTCH1NICD蛋白Thr1861位点磷酸化抗体，可用于Westernblot实验检测正常细胞、肿瘤细胞及治疗前后肿瘤细胞的表达差异，可以采用免疫共沉淀结合质谱技术(IP-MS)、GST-pulldown等方法研究磷酸化修饰的NOTCH1NICD的蛋白间相互作用；可以采用染色体免疫共沉淀测序(ChIP-seq)研究磷酸化修饰的NOTCH1NICD相互作用的DNA调控元件，从而为阐述NOTCH蛋白的磷酸化修饰在肿瘤等疾病发生发展过程中的作用及其机制提供独特的工具；此外，还可以通过免疫组化(IHC)和ELISA等方法检测人NOTCH1NICD蛋白的磷酸化水平，探讨其与肿瘤、血液系统、心血管系统等疾病的关系，在疾病诊断、治疗及预后判定等方面具有广泛的临床应用前景。本专利技术的优点及实现的有益效果：(1)本专利技术所述人NOTCH1NICD蛋白Thr1861位点磷酸化抗体具有高特异性、高亲和力的特性；(2)在长期的实验中，本专利技术的专利技术人无意中发现，在本专利技术所述的纯化磷酸化抗体中采用的亲和纯化-亲和分离方法比现有技术中的纯化磷酸化抗体中采本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人NOTCH1 NICD蛋白的抗原肽，其特征是，其活性氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，且其中的Thr氨基酸被磷酸化。

【技术特征摘要】
1.一种人NOTCH1NICD蛋白的抗原肽，其特征是，其活性氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，且其中的Thr氨基酸被磷酸化。2.根据权利要求1所述的人NOTCH1NICD蛋白的抗原肽，其特征是，所述人NOTCH1NICD蛋白的抗原肽的C末端连接有一个半胱氨酸。3.一种人NOTCH1NICD蛋白的抗体，其特征是，其是通过权利要求1或2所述的人NOTCH1NICD蛋白的抗原肽免疫动物制备得到的。4.权利要求1或2所述的抗原肽在制备用于肿瘤的诊断、治疗、预后判定的药物或试剂中的应用。5.权利要求3所述的人NOTCH1NICD蛋白的抗体在制备用于肿瘤的诊断、治疗、预后判定的药物或试剂中的应用。6.一种用于肿瘤的诊断、治疗、预后判定的药物或试剂，其特征是，其包括有权利要求1或2所述的人NOTCH1NICD蛋白的抗原肽和/或权利要求3所述的抗体。7.根据权利要求4或5所述的应用，权利要求6所述的药物或试剂，其特征是，所述肿瘤为与人NOTCH1信号通路相关的肿瘤。8.一种人NOTCH1NICD蛋白的抗体的制备方...

【专利技术属性】
技术研发人员：宁云山，邱晓媚，李妍，薛杨，
申请(专利权)人：南方医科大学，珠海南医大生物医药公共服务平台有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44