本发明专利技术涉及一种环状的合成多肽PV及其抗菌应用。本发明专利技术所涉及的环状的合成多肽PV分别具有序列列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列及结构特征；环状的合成多肽PV衍生自序列列表中SEQ ID No.2所示LBDv活性多肽；经对本发明专利技术涉及的环状的合成多肽PV进行生物功能体外验证，证实其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长或增殖均具有很强的抑制作用。
Modified cyclic polypeptide PV and its application and antibacterial preparation
The present invention relates to a cyclic synthetic polypeptide PV and its antibacterial application. The synthesis of cyclic peptide PV of the invention respectively with the amino acid sequence and structure characteristics of SEQ ID sequence in the list shown in the No.1; synthetic peptide PV cyclic sequence derived from the list of SEQ ID No.2 LBDv shown by synthesis of bioactive peptides; cyclic peptide PV of the invention relates to the biological in vitro functional verification, confirmed the gram positive and gram negative bacteria growth or proliferation have very strong inhibition.
【技术实现步骤摘要】
一种改造环状多肽PV及其应用和抗菌制剂
本专利技术涉及一种环状的合成多肽PV及其抗菌应用，具体地说是一种合成的衍生自LBDv活性多肽的结构改造环状多肽及其抗菌应用。
技术介绍
对虾的养殖在我国的水产养殖业中占有重要地位，近些年来，对虾养殖过程中的病害问题已经严重阻碍了其养殖生产的健康发展，抗生素的滥用与环境的恶化使海水养殖动物的病害难以从根本上得到控制。抗菌肽(蛋白)被认为是鱼、虾、贝等防御细菌、病毒等外源病原感染的重要效应分子，在动物的先天免疫过程中发挥重要作用。目前从甲壳动物中发现的抗菌肽种类繁多，抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharidefactor，ALF)就是其中一种重要的抗菌肽。1982年，Tanaka等首次从中国鲎(Tachypleustridentatus)和北美鲎(Limuluspolyphemus)的血细胞中分离得到ALF，并发现其能抑制LPS介导的凝血反应的激活。1985年，Morita等发现ALF还具有很强的抗革兰氏阴性菌活性。之后，人们相继在斑节对虾(Penaeusmonodon)、中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)、日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、桃红对虾(Farfantepenaeusduorarum)等多种甲壳动物中发现ALF编码基因的存在，并证实ALF基因的重组蛋白具有广泛的抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌生长的活性。另外，研究还发现对虾白斑综合征病毒(WSSV)预先与重组表达的ALF蛋白一起孵育后再注射入虾体中，能明显抑制注入虾体中的WSSV的复制。与传统抗生素的作用机理不同，ALF能直接中和细菌细胞壁的脂多糖，溶解细菌，因此不易引起细菌的耐药性。ALF抗病毒的作用机理目前尚不清楚。随着抗生素的应用，许多病原菌对现有抗生素逐步产生耐药性，而新型抗生素的发现又极其困难，因此，ALF的研究为开发新型抗菌药物提供了重要基础。研究发现，ALF氨基酸序列中的两个保守半胱氨酸之间形成二硫键，这两个半胱氨酸之间的氨基酸共同组成一段阴离子多肽，具有与LPS结合的能力，这段保守的结构被命名为LPS结合结构域，被认为是ALF降解革兰氏阴性菌细胞壁脂多糖的功能域。2011年，SachinSharma等研究了根据锯缘青蟹(Scyllaserrata)ALF的LPS结合结构域合成的具24个氨基酸残基的多肽在抗菌免疫过程中作用，发现合成多肽SsALF24具有结合LPS的活性并且对大肠杆菌都具有明显的抑制作用，其最小抑制浓度为16.16～32.32uM(SharmaS，YederyRD，PatgaonkarMS，SelvaakumarC，ReddyKV.AntibacterialactivityofasyntheticpeptidethatmimicstheLPSbindingdomainofIndianmudcrab，Scyllaserrataanti-lipopolysaccharidefactor(SsALF)alsoinvolvedinthemodulationofvaginalimmunefunctionsthroughNF-kBsignaling.Microbialpathogenesis2011；50∶179-191.)。前期研究发现，中国明对虾中ALF的LPS结合结构域具有不同的抗菌抗病毒作用，通过中国明对虾ALF的LPS结合结构域改造获得的LBDv多肽分子表现出显著的抗菌抗病毒作用(YangH，LiSH，LiFH，XiangJH.StructureandbioactivityofamodifiedpeptidederivedfromtheLPS-bindingdomainofananti-lipopolysaccharidefactor(alf)ofshrimp.Mar.Drugs2016，14，96；doi：10.3390/md14050096.)。基于发表的活性多肽LBDv的氨基酸序列，本专利技术对其序列进行氨基酸替换、序列缩短等进一步改造，利用化学合成的方法获得了改造后的环形多肽PV，它们显示出显著的抗菌生物学活性，具有重要的应用前景。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种经过结构改造的环状合成多肽PV，它们具有明显的抗菌活性。本专利技术的技术方案如下：利用化学合成的方法获得了环状的合成多肽PV，具有SEQIDNo.1所示的氨基酸序列，其序列特征为：SEQIDNo.1：Ac-c(CKPKFKRWKLKFKKWC)-NH2所述的环状的合成多肽PV序列具有二硫键结构。其结构特征在于：合成多肽PV的氨基端第一个半胱氨酸(C)和羧基端第一个半胱氨酸(C)之间具有二硫键结构；多肽的氨基端C的氨基被乙酰化(Ac-)，羧基端C的羧基被酰胺化(-NH2)。所述的环状合成多肽PV衍生自活性多肽LBDv的结构改造。LBDv的特征在于：具有序列列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。所述的环状的合成多肽PV具有明显的抗菌活性。具体为：对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长或增殖均具有很强的抑制作用。所述环状的合成多肽PV可作为抗菌的活性成份，可用于制备抗菌的药物或制剂中。本专利技术有如下优点1、本专利技术确定了一种衍生自活性多肽LBDv结构改造的抗菌多肽PV及其结构特征。2、通过本专利技术可开发有效的细菌类疾病的防治药物。附图说明图1合成多肽PV的空间结构图；图2合成多肽PV的HPLC纯度检测图；图3合成多肽PV的MS质谱鉴定图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细说明。一种化学合成的具有明显抗菌活性的对虾环状多肽PV，它们的序列及来源序列信息如下：(1)SEQIDNo.1的信息(a)序列特征*长度：16氨基酸*类型：氨基酸*链型：单链*拓扑结构：环形，两个半胱氨酸之间形成二硫键*空间结构：两个半胱氨酸之间通过二硫键相连接，形成环状结构，具有图1所示空间结构：多肽序列形成两个相连的β折叠结构。(b)分子类型：蛋白序列描述：SEQIDNo.1Ac-c(CKPKFKRWKLKFKKWC)-NH2其中括号内的氨基酸为成环的氨基酸，括号外左侧的小写c表示括号内的氨基酸为形成环状结构氨基酸；Ac-表示氨基酸C的氨基被乙酰化；-NH2表示氨基酸C的羧基被酰胺化。(2)SEQIDNo.2的信息(a)序列特征*长度：24氨基酸*类型：氨基酸*链型：单链*拓扑结构：环形，两个半胱氨酸之间形成二硫键(b)分子类型：蛋白序列描述：SEQIDNo.2Ac-Yc(CKFRVKPKFKRWRLRFKGRMWC)P-NH2所述抗菌多肽PV的合成、环化、纯化、鉴定及生物活性分析：通过人工化学合成途径，利用固相合成方法获得粗品多肽，经固相环化、质谱鉴定和液相色谱纯化获得含有二硫键的合成多肽PV。具体为：1)多肽合成采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)合成策略，从C端向N端方向合成。用10mgRink-Amide-Resin树脂(AAPPTec，货号RRZ001)作为载体，依靠载体本身的活性基团与5mg被Fmoc进行氨基保护的第一个氨基酸(Fmoc-Pro-NH2)的羧基相连(详细方法参考文献：PanagiotisStatho本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种环状的合成多肽PV，其特征在于：所述的环状的合成多肽PV序列具有二硫键结构，多肽PV的氨基端第一个氨基酸残基(半胱氨酸，C)和羧基端第一个氨基酸残基(半胱氨酸，C)之间具有二硫键结构；序列为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种环状的合成多肽PV，其特征在于：所述的环状的合成多肽PV序列具有二硫键结构，多肽PV的氨基端第一个氨基酸残基(半胱氨酸，C)和羧基端第一个氨基酸残基(半胱氨酸，C)之间具有二硫键结构；序列为SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。2.按照权利要求1所述的环状的合成多肽PV，其特征在于：SEQIDNo.1为Ac-c(CKPKFKRWKLKFKKWC)-NH2。3.按照权利要求1所述的环状的合成多肽PV，其特征在于：所述的环状的合成多肽PV衍生自LBDv活性多肽序列的结构改造，LBDv具有序列列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。4.一...
【专利技术属性】
技术研发人员：李诗豪，李富花，相建海，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37
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