一种抗肥胖七肽NPVWKRK制造技术

本发明专利技术公开了一种抗肥胖七肽NPVWKRK，该合成多肽的氨基酸序列如下所示：Asn‑Pro‑Val‑Trp‑Lys‑Arg‑Lys，缩写为NPVWKRK，分子量927.12，纯度98.95%。本发明专利技术的七肽NPVWKRK使用多肽合成仪，采用固相合成法合成。通过体外小鼠前脂肪细胞3T3‑L1增殖抑制活性检测，在浓度0.125‑2 mg/mL范围内，本发明专利技术的多肽对3T3‑L1呈现出了一定的抑制效果。在2 mg/mL时，对3T3‑L1的体外增殖抑制率为45.38%。本发明专利技术提供一种具有潜在体外抗肥胖活性的合成多肽，可应用于生物制药领域。

An anti obesity seven peptide NPVWKRK

The invention discloses an anti obesity seven peptide NPVWKRK, the amino acid sequence of the synthetic peptides are shown as follows: Asn Pro Val Trp Lys Arg Lys, abbreviated as NPVWKRK, molecular weight 927.12, purity 98.95%. The seven peptide NPVWKRK of the invention uses a peptide synthesizer and is synthesized by solid phase synthesis. By in vitro mouse 3T3 preadipocyte proliferation L1 inhibitory activity was detected in the concentration of 0.125, 2 mg/mL range, the polypeptides of the invention of 3T3 L1 showed a certain inhibitory effect. In 2 mg/mL, 3T3 on proliferation of L1 in vitro inhibition rate was 45.38%. The present invention provides a synthetic polypeptide with potential anti obesity activity in vitro and can be applied in the field of biological pharmacy.

【技术实现步骤摘要】
一种抗肥胖七肽NPVWKRK
本专利技术属于生物制药领域，具体涉及一种合成多肽及其应用。
技术介绍
生物活性肽是对机体的功能或状态具有积极作用并最终影响机体健康的特殊蛋白质片段。相较于蛋白质而言，小分子肽片段的优越性主要体现在：更易被人体吸收利用；活性高，在较小浓度下即可发挥其特有的生理作用；分子量小，易于修饰和改造，能够通过人工化学合成等。而相较于单一的氨基酸而言，小分子肽除了具有特殊的生理活性外，在吸收通道和吸收速度上也具有氨基酸无可比拟的优越性。已有研究证实，人体小肠存在专门的低聚肽吸收通道，人体摄入的蛋白质经过多种消化酶的水解，主要以低肽的形式被吸收。许多研究表明，各种来源的生物活性肽具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌、降压、降血糖等多种作用，成为生物医药和保健品开发的热点。肥胖增加动脉粥样硬化，冠心病，高血压，糖尿病，痛风，脂肪肝等疾病的发病危险。因此，对具有减肥降脂作用而安全无害的生物活性肽的开发研究，变得尤为重要。目前，具有减肥降脂作用的多肽包括利拉鲁肽，鲈鱼活性肽，蚕蛹肽等。
技术实现思路
本专利技术选取小鼠前脂肪细胞3T3-L1为研究对象，使用MTT法测定合成肽的体外抑制活性。本专利技术的目的是提供一种具有体外抗肥胖活性的合成多肽，可应用于生物制药领域。本专利技术合成的抗肥胖七肽缩写为NPVWKRK，分子量927.12，序列为：Asn-Pro-Val-Trp-Lys-Arg-Lys。其中，Asn表示英文名称为Asparagine，中文名称为天冬酰胺酸的氨基酸的相应残基;Pro表示英文名称为Proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸的相应残基；Val表示英文名称为Valine，中文名称为缬氨酸的氨基酸的相应残基;Trp表示英文名称为Tryptophan，中文名称为色氨酸的氨基酸的相应残基;Lys表示英文名称为Lysine，中文名称为赖氨酸的氨基酸的相应残基;Arg表示英文名称为Arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基;Lys表示英文名称为Lysine，中文名称为赖氨酸的氨基酸的相应残基。本专利技术所述的氨基酸序列采用标准Fmoc方案，通过树脂的筛选，合理的多肽合成方法。将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N端合成。本专利技术将终浓度为0.125-2mg/mL的合成多肽与3T3-L1混匀，孵育48h后，经MTT法检测，对脂肪细胞抑制率达到14.59%-45.38%,可在制备生物医药领域中应用。所述七肽NPVWKRK在浓度为2mg/mL时，对3T3-L1的体外增殖抑制率为45.38%。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和技术效果：本专利技术首次合成了该肽，并且采用MTT方法检测了合成多肽的体外脂肪细胞增殖抑制活性，所述合成多肽具有一定的脂肪细胞抑制能力。附图说明图1a为合成多肽Asn-Pro-Val-Trp-Lys-Arg-Lys的HPLC图。图1b为合成多肽Asn-Pro-Val-Trp-Lys-Arg-Lys的MS图。图2为合成多肽Asn-Pro-Val-Trp-Lys-Arg-Lys对脂肪细胞3T3-L1的抑制活性柱状图。具体实施方式以下结合具体实例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术的实施和保护范围不限于此。多肽固相合成选用高分子树脂（中肽生化有限公司），按照氨基酸序列Asn-Pro-Val-Trp-Lys-Arg-Lys的特征，先将Lys的羧基以共价键的形式与一个树脂相连，然后Lys的氨基和Arg的羧基缩水反应，处理后，再添加Lys，Arg的氨基和Lys的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个Asn氨基酸后，再切除树脂即得到目标多肽。采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱型号为PhenomenexC18，尺寸4.6*150mm，流动相A:含有0.1%三氟乙酸（TFA）的水；流动相B:含有0.09%TFA的溶液(80%乙腈+20%水)；20min内B相由14.0%上升到24.0%，流速1.0mL/min，检测波长220nm。液氮速冻，冷冻干燥，得到最后的产品，要求纯度达到98.95%以上，并经MS鉴定结构（如图1所示）。合成多肽的体外抑制活性通过MTT比色法分析肽组分对3T3-L1的生长抑制作用。具体操作步骤如下：1）取对数生长期的细胞，经0.25%（体积）的胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加入相应的完全培养基终止消化并重悬细胞，血球平板计数后，调整细胞悬液的浓度至5×104个/mL，加至96孔板中，每孔100µL,于37℃恒温CO2培养箱中培养；2）培养24h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200µL的含有不同浓度待测样品的新鲜完全培养基，并以完全培养基为阴性对照，于37℃恒温CO2培养箱中培养；3）48h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20µl和新鲜完全培养基180µL；于37℃恒温CO2培养箱中继续培养；4）4h后，弃去含有MTT的培养液，加入150µlDMSO后于微型振荡器上振荡15min，490nm波长处测定光密度值并计算抑制率:脂肪细胞生长抑制率(%)=((对照组OD-空白组OD)-(给药组OD-空白组OD))/((对照组OD-空白组OD))×100。应用实施例1脂肪细胞3T3-L1100µL细胞悬液(5×104个/mL),加至96孔板中，于37℃恒温CO2培养箱中培养，24h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为100µL的125µg/mL的多肽样品的新鲜完全培养基，并以完全培养基为阴性对照，于37℃恒温CO2培养箱中培养，48h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20µl和新鲜完全培养基180µL；于37℃恒温CO2培养箱中继续培养；4h后，弃去含有MTT的培养液，加入150µlDMSO后于微型振荡器上振荡15min，490nm波长处测定光密度值并计算抑制率。由图2可知，125µg/mL的多肽对脂肪细胞3T3-L1的抑制率是14.59%。应用实施例2脂肪细胞3T3-L1100µL细胞悬液(5×104个/mL),加至96孔板中，于37℃恒温CO2培养箱中培养，24h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为100µL的250µg/mL的多肽样品的新鲜完全培养基，并以完全培养基为阴性对照，于37℃恒温CO2培养箱中培养，48h后吸出药液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20µl和新鲜完全培养基180µL；于37℃恒温CO2培养箱中继续培养；4h后，弃去含有MTT的培养液，加入150µlDMSO后于微型振荡器上振荡15min，490nm波长处测定光密度值并计算抑制率。由图2可知，250µg/mL的多肽对脂肪细胞3T3-L1的抑制率是24.93%。应用实施例3脂肪细胞3T3-L1100µL细胞悬液(5×104个/mL),加至96孔板中，于37℃恒温CO2培养箱中培养，24h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为100µL的500µg/mL的多肽样品的新鲜完全培养基，并以完全本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗肥胖七肽NPVWKRK，其特征是该七肽NPVWKRK的氨基酸序列为Asn‑Pro‑Val‑Trp‑Lys‑Arg‑Lys 。

【技术特征摘要】
1.一种抗肥胖七肽NPVWKRK，其特征是该七肽NPVWKRK的氨基酸序列为Asn-Pro-Val-Trp-Lys-Arg-Lys。2.如权利要求1所述的一种抗肥胖七肽NPVWKRK，其特征在于所述七肽NPVWKRK在浓度为0.125-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学武，崔玉矫，赵冰丽，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44