一种组织工程脱细胞血管支架的制备方法技术

一种组织工程脱细胞血管支架的制备方法，通过微米级高分子聚合物支架埋植到宿主皮下或者腹腔，利用宿主免疫保护机制包裹该血管支架后进行脱细胞处理，从而获得无免疫原性的加强型组织工程血管。本发明专利技术的优点是：本发明专利技术解决了脱细胞组织工程化血管力学性能不足，多层相互交联的网状高分子支架充分改善了原有脱细胞血管支架的力学性能；解决了组织工程血管在异体移植时的免疫原性问题，宿主动物体内构建由免疫机制引起的迁移细胞形成的支架血管，经过脱细胞处理，降低移植后的免疫反应，充分利用了细胞外基质提供细胞再生的良好环境；本方法还可以通过设计不同形状和大小的支架来制备不同的脱细胞血管支架，以应用于不同的血管移植条件。

Preparation method of tissue engineering decellularized blood vessel stent

The invention relates to a preparation method of acellular vascular tissue engineering scaffolds, by micron polymer stent implanted into subcutaneous or intraperitoneal host, the host immune protection mechanism of wrapping the stent after acellular treatment, so as to obtain vascular tissue engineering to enhance the immunogenicity of the. The invention has the advantages that the invention solves acellular vascular tissue engineering mechanical properties, mesh intercrosslinked multilayer polymeric scaffolds improve original mechanical properties of acellular vascular scaffold; solve the immunogenicity of tissue engineering blood vessels in allogeneic transplantation, the host animal in vivo construction of migrating cells caused by vascular stent the formation of the immune mechanism, after acellular treatment, reduce the immune response after transplantation, make full use of the extracellular matrix to provide a good environment for cell regeneration; this method can also support design of different shape and size of the prepared acellular vascular scaffold should be different, with different conditions for vascular graft.

【技术实现步骤摘要】
一种组织工程脱细胞血管支架的制备方法
本专利技术涉及一种组织工程脱细胞血管支架的制备方法。
技术介绍
心血管疾病是人类健康的第一杀手，其中半数以上患者治疗的首选是血管移植，但由于部分患者受自身血管来源的限制而难以实施。异体或异种血管曾经作为自体血管的替代物，用于修复病变或缺失的血管，但潜在的疾病传播风险、急性免疫排斥反应及有限的供体来源又限制了其在移植中应用。组织工程技术的发展为人体血管缺损修复和重建提供了新的解决方案，目前已开发出了多种合成的可降解材料用于构建组织工程支架，并应用于临床，取得了良好的效果。组织工程血管是一种用组织工程学方法构建的具有良好生物相容性和力学特性的血管替代物，其基本的构件是血管支架材料、种子细胞和信号因子，而血管支架的研究一直是目前血管组织工程研究领域的难点和重点。其中，天然生物支架材料利用自体或者异体血管进行脱细胞处理，获得细胞外基质，由于这些胞外基质与细胞亲和力强，能为细胞生长、繁殖、分化提供近似体内组织发育环境，且生物相容性、顺应性均较好，免疫排斥也较低，因此有潜力应用到组织工程化血管中。然而，这些异体或异种来源的脱细胞支架应用到小口径(内径小于6mm)血管移植时，在口径小、张力大的血管环境中存在着力学性能不足而导致严重动脉瘤等问题。因此，要实现脱细胞血管支架在小口径组织工程化血管中的广泛应用，必须解决支架力学性能不足的问题。熔融纺丝和湿法纺丝等技术可以利用一些生物相容性较好的高分子材料制备出具有较好力学性能的支架，这种支架的纤维直径和纤维取向可控，能够在血流方向和血管径向提供较好的力学支持，从而满足体内血流刺激对力学性能的要求，因此在组织工程化血管研究中受到重视。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述存在问题，将脱细胞的组织工程化血管和用熔融纺丝等技术制备的力学支架相结合，专利技术一种可以有效增强力学性能的组织工程脱细胞血管支架的制备方法，本方法制备的脱细胞血管支架具有力学性能显著增强、体内移植后免疫反应低、可以设计不同形态的血管支架以满足实际临床应用的特点。本专利技术的技术方案：一种组织工程脱细胞血管支架的制备方法，包括以下步骤：1)以生物可降解高分子材料为原料，在医用硅胶管上采用熔融纺丝或湿法纺丝技术制备微米级或纳米级的有序网状血管支架，所述有序网状血管支架的纤维在硅胶管外螺旋式缠绕，纤维之间的角度为45°，网状血管支架层的厚度为600μm，血管支架的直径为2mm；2)将上述带硅胶管的纤维支架植入到兔子或大鼠实验动物皮下部位2周到3个月，宿主启动免疫反应机制并使成纤维细胞等向支架上迁移，最终形成一个由宿主细胞及胞外基质包裹的组织工程化血管支架；3)将上述组织工程化血管支架取出，移除硅胶管后，对其外层的血管材料进行如下处理：用75wt％的酒精消毒20min，转移至超净台操作，用1wt％的十二烷基磺酸钠(SDS)在摇床上震荡12h后，用双蒸馏水(DDH2O)将SDS完全洗去，用100U的DNA酶和40U的RNA酶摇床震荡处理24h，用DDH2O将酶完全洗去，得到组织工程脱细胞血管支架。所述生物可降解高分子材料为聚己内酯(PCL)、聚L-丙交酯-co-己内酯(PLCL)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)和聚氨酯(PU)中的一种或两种及以上任意比例的混合物。一种所制备的组织工程脱细胞血管支架的应用，用于实验动物的血管移植。本专利技术的优点在于：1、多层相互交联的网状高分子支架充分改善了原有脱细胞血管支架的力学性能，成功解决了血管移植后的动脉瘤等问题；2、本方法在宿主动物体内构建由免疫机制引起的迁移细胞形成的支架血管，再进行脱细胞处理，既保留了网状支架以改善血管力学性能，又降低移植后的免疫反应，并且充分利用了细胞外基质提供细胞再生的良好环境；3、本方法还可以通过设计不同形状和大小的支架来制备不同的脱细胞血管支架，以应用于不同的血管移植条件。附图说明：图1为脱细胞血管立体结构示意图。图2为脱细胞血管支架剖面结构放大示意图。图中：1，免疫包裹材料；2，高分子纤维；3，医用硅胶管。具体实施方式实施例1：一种组织工程脱细胞血管支架的制备方法，采用熔融纺丝技术以PCL为原料制备，包括以下步骤：1)将20克分子量为8000的PCL加入到熔融纺丝机的料筒中，将料筒升温到210℃并保持1h，调整料筒针头与外径为2mm的医用硅胶管的距离为1cm，设定料筒推进流速为0.5mL/h，接收硅胶管转速为300rpm，水平移动速度为10mm/s，移动距离为10cm，纺丝时间为12min，得到在硅胶管外纤维呈螺旋式缠绕的有序网状血管支架；2)将上述带有硅胶管的PCL有序网状血管支架剪为每段2cm，用环氧乙烷灭菌，将大鼠麻醉后，背部两侧剃光成长6cm、宽2cm矩形面，用剪刀剪开1cm长切口，用平头剪刀将皮层与肌肉组织分离出长4cm、宽1cm、深0.3cm的空腔，将PCL纤维支架平整埋入到空腔中，将切口缝合后消毒，在皮下埋植一个月后，将大鼠麻醉后，在植入支架材料的另一侧脱毛切口，将材料与周围组织剥离后取出，剔除多余的结缔组织后得到一个由宿主细胞及胞外基质包裹的组织工程化血管支架；3)将上述得到的血管支架用75wt％的酒精消毒20min，转移至超净台操作，用1wt％的十二烷基磺酸钠(SDS)处理12h后，用双蒸馏水(DDH2O)将SDS完全洗去，用100U的DNA酶和40U的RNA酶处理处理24h，用DDH2O将酶完全洗去，得到脱细胞血管支架，放入磷酸缓冲盐溶液中备用，所述磷酸缓冲盐溶液的组成：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO42mmol/L；溶液pH为7.2～7.4。所制备的组织工程脱细胞血管支架用于实验动物的血管移植，方法如下：将得到的脱细胞血管支架进行大鼠腹主动脉血管移植实验，通过苏木素伊红染色和免疫荧光染色评价其组织相容性和血管再生情况，通过小动物多普勒超声成像仪检测血管再大鼠体内的形态和通畅性，对移植血管取材后进行力学性能评价。组织学染色分析可见该脱细胞血管支架与机体之间没有明显免疫排斥反应，组织相容性良好；多普勒超声成像显示血管形态保持正常，血流通畅；力学测试结果表明，该脱细胞组织工程化血管支架的爆破压、拉伸强度等力学性能可以满足生理所需。实施例2：一种组织工程脱细胞血管支架的制备方法，采用湿法纺丝技术以PLCL为原料制备，包括以下步骤：1)将1克PLCL溶解到10mL六氟异丙醇中，室温搅拌至全部溶解，将直径为2mm的医用硅胶管与旋转电机相连，将PLCL溶液吸入注射器中，注射器针头置入到乙醇凝固浴中距离硅胶管1cm位置。设定溶液流速为2ml/h，接收硅胶管转速为500rpm，纺丝时间为40min，得到在硅胶管外纤维呈螺旋式缠绕的有序网状血管支架，制备完成后将血管支架真空干燥备用；2)将上述得到的内径为2mm的有序网状血管支架裁剪成长为3cm的血管支架，用75wt％医用酒精灭菌后用无菌生理盐水置换备用，将兔子麻醉后，背部两侧剃光成长6cm、宽4cm的矩形面，用剪刀剪开1cm长切口，用平头剪刀将皮层与肌肉组织分离出长4cm、宽1cm、深0.3cm的空腔，将剪好的纤维支架材料平整放入到空腔中，将切本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组织工程脱细胞血管支架的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)以生物可降解高分子材料为原料，在医用硅胶管上采用熔融纺丝或湿法纺丝技术制备微米级或纳米级的有序网状血管支架，所述有序网状血管支架的纤维在硅胶管外螺旋式缠绕，纤维之间的角度为45°，网状血管支架层的厚度为600μm，血管支架的直径为2mm；2)将上述带硅胶管的纤维支架植入到兔子或大鼠实验动物皮下部位2周到3个月，宿主启动免疫反应机制并使成纤维细胞等向支架上迁移，最终形成一个由宿主细胞及胞外基质包裹的组织工程化血管支架；3)将上述组织工程化血管支架取出，移除硅胶管后，对其外层的血管材料进行如下处理：用75wt％的酒精消毒20min，转移至超净台操作，用1wt％的十二烷基磺酸钠(SDS)在摇床上震荡12h后，用双蒸馏水(DDH

【技术特征摘要】
1.一种组织工程脱细胞血管支架的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)以生物可降解高分子材料为原料，在医用硅胶管上采用熔融纺丝或湿法纺丝技术制备微米级或纳米级的有序网状血管支架，所述有序网状血管支架的纤维在硅胶管外螺旋式缠绕，纤维之间的角度为45°，网状血管支架层的厚度为600μm，血管支架的直径为2mm；2)将上述带硅胶管的纤维支架植入到兔子或大鼠实验动物皮下部位2周到3个月，宿主启动免疫反应机制并使成纤维细胞等向支架上迁移，最终形成一个由宿主细胞及胞外基质包裹的组织工程化血管支架；3)将上述组织工程化血管支架取出，移除硅胶管后，对其外层的血管材料进行如下处理：用75wt％的酒精消毒20min，转...

【专利技术属性】
技术研发人员：王恺，孔德领，程曲汉，朱美峰，张秋影，傅迪宏，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12