本发明专利技术公开了一种罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖疫苗的制备方法及其应用。所述荚膜多糖疫苗由罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖制备所得。本发明专利技术以罗非鱼源无乳链球菌为研究对象，从罗非鱼源无乳链球菌中提取出荚膜多糖，与破伤风类毒素载体结合，获得一种特异性强、具有免疫保护效力为69.48％±6.24％的荚膜多糖疫苗，为罗非鱼无乳链球菌病的免疫防治奠定了基础。
Preparation method of tilapia Streptococcus capsular polysaccharide vaccine and application thereof
The invention discloses a preparation method of tilapia Streptococcus capsular polysaccharide vaccine and an application thereof. The capsular polysaccharide vaccine is prepared from Tilapia origin Streptococcus lactis capsular polysaccharide. With the invention of Streptococcus agalactiae isolated from Tilapia as the research object, extracted capsular polysaccharide from Streptococcus agalactiae isolated from tilapia, combined with tetanus toxoid carrier, to obtain a high specificity, with immune protective efficacy was 69.48% + 6.24% capsular polysaccharide vaccine, which laid the foundation for the immunological control of Streptococcus agalactiae from Tilapia disease.
【技术实现步骤摘要】
一种罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖疫苗的制备方法及其应用
本专利技术属于疫苗学
更具体地，涉及一种罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖疫苗的制备方法及其应用
技术介绍
无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)是一种人畜鱼共患革兰氏阳性菌，能引起新生儿脑膜炎、牛乳腺炎和鱼类脑膜脑炎。无乳链球菌能感染多种海水、淡水鱼类并引起死亡，给我国乃至世界水产养殖业造成重大经济损失。因此，研究无乳链球菌相关的防治技术具有很重要的现实意义。目前，在国内已有一些与链球菌疫苗相关的专利。申请号：200580013779.X，专利技术名称：无乳链球菌疫苗公布了一种β溶血性无乳链球菌的完整灭活细胞和该菌培养物的浓缩提取物制备的组合疫苗通过注射和浸泡两种方式对罗非鱼抗无乳链球菌的免疫保护效果分别为80％和35％。申请号：200780025577.6，专利技术名称：抗链球菌的联合疫苗公布了一种联合疫苗，当难辨链球菌和海豚链球菌在疫苗制剂中的比例(基于细胞∶细胞)为20∶1或40∶1时，可得到抗难辨链球菌的64％的相对保护率和抗海豚链球菌的71％的相对保护率。申请号：201080047156.5，专利技术名称：链球菌组合疫苗，公布了一种组合疫苗，包含无乳链球菌生物型1血清型Ia细胞和血清型III细胞的组合疫苗提供针对罗非鱼抗无乳链球菌生物型1血清型Ia的88.9％保护率和抗罗非鱼无乳链球菌生物型1血清型III的92％的保护率。申请号：201010207289.6，专利技术名称：罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法，公布了一种罗非鱼无乳链球菌和海豚链球菌等体积混合二联疫苗的制备过程。申请号：201210337267.0，专利技术名称：一种预防罗非鱼链球菌病的疫苗，公布了一种无乳链球菌全菌灭活疫苗通过浸泡、注射和口服免疫罗非鱼后最高分别能达到60％、90％和75％的免疫保护率。申请号：201410121138.7，申请名称：一种无乳链球菌的口服疫苗及其制备方法，构建一种表达无乳链球菌sip蛋白的重组减毒沙门氏菌，将其拌料投喂罗非鱼后最高可获得63％的抗无乳链球菌免疫保护率。但是，以上公开使用的无乳链球菌疫苗均是单一或是二联全菌灭活疫苗，尚未出现荚膜多糖疫苗。荚膜多糖是细菌的保护性抗原和毒力因子，是细菌结构变化最少的表面抗原，具有较好的免疫原性，是最适宜做疫苗成分的靶抗原之一，纯化的荚膜多糖制备的疫苗具有较好的效果。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术旨在提供一种罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖疫苗的制备方法及其应用。本专利技术提供的无乳链球菌荚膜多糖联合疫苗包含无乳链球菌荚膜多糖与蛋白载体的联合物，所述的疫苗为液体制剂。其中所述蛋白载体为破伤风类毒素。本专利技术提供的无乳链球菌荚膜多糖联合疫苗其每一单位给药剂量的制剂中含有无乳链球菌荚膜多糖的量为5ug.本专利技术中的无乳链球菌荚膜多糖，可通过以下制备工艺制备：1)将无乳链球菌菌种接种于装有5mLBHI液体培养基的试管中，置于恒温培养摇床(28℃，160rpm)培养12h，以备扩大培养用；2)将培养所得菌液5ml，接种于装有500mlBHI液体培养基的三角烧瓶中，在恒温培养摇床(28℃，160rpm)中振荡培养10h；3)低温离心菌液，将菌体用PBS溶解并高压蒸汽灭菌；4)离心灭菌后的溶液，取上清，并使用0.22um针头滤器过滤上清；5)在过滤后的悬液中加入终浓度为1％的CTAB，充分搅拌后4℃静置过夜；6)离心CTAB结合物，收集沉淀物，即为复合多糖；7)将复合多糖溶入2mol/l氯化钙溶液中搅拌，充分溶解后离心取上清；8)向上清溶液中加入两倍体积的80％乙醇，4℃静置2天；9)离心收集沉淀，即为粗糖；10)粗糖用无水乙醇洗涤后，溶入饱和乙酸钠中；11)用酚：氯仿：异戊醇之比为25∶24∶1的溶液提蛋白5次；12)装入透析袋内，去离子水透析2天，每12h换透析外液1次；13)取出透析袋内液体，加入两倍体积无水乙醇，4℃静置2天；14)离心液体，并将液体放入-80℃冰箱冻块；15)冻干机冻干，即得荚膜多糖；本专利技术使用的蛋白载体破伤风类毒素，从公司购买所得；本专利技术提供的所述联合疫苗的制备方法，荚膜多糖和载体蛋白按质量比2∶1混合得到；本专利技术的联合疫苗制剂，以破伤风类毒素作为无乳链球菌荚膜多糖的载体蛋白免疫鱼体，可唤起免疫系统对破伤风类毒素的回忆反应，从而得到较好的对无乳链球菌荚膜多糖的免疫反应；本专利技术提供的无乳链球菌荚膜多糖联合疫苗经腹腔注射免疫罗非鱼后可激发罗非鱼机体产生抗无乳链球菌荚膜多糖的抗体。本专利技术的另一个目的在于提供所述的联合疫苗在预防或治疗无乳链球菌诱发的疾病的疫苗中的应用。本专利技术的荚膜多糖疫苗制备方法中荚膜多糖的提取是应用了化学试剂十六烷基三甲基溴化铵与多糖可以形成季胺络合物而沉淀多糖的原理，这种方法对多糖的针对性较高，纯化的效率较高，而且方法简便易行，应用的设备都为常规设备，操作简便适用，制备过程安全适于大规模生产应用。上述方法制备得到的罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖疫苗，以及所述罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖疫苗在制备防治罗非鱼无乳链球菌病的药物或制剂方面的应用，也都应在本专利技术的保护范围之内。附图说明图1为荚膜多糖疫苗免疫罗非鱼后攻毒的存活曲线。横坐标为攻毒后天数；纵坐标为存活率。图2为荚膜多糖疫苗Elisa检测血清抗体滴度；横坐标为初免后第2、4周的血清；纵坐标为抗体滴度，抗体滴度用产生阳性结果的最大稀释倍数表示。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术但不用来限制本专利技术的范围。实施例1无乳链球菌荚膜多糖的制备1、粗糖的提取将无乳链球菌菌种接种于装有5mLBHI液体培养基的试管中，置于恒温培养摇床(28℃，160rpm)培养12h；将培养所得菌液5ml，接种于装有500mlBHI液体培养基的三角烧瓶中扩大培养，在恒温培养摇床(28℃，160rpm)中振荡培养10h；将培养好的细菌低温离心(4℃，4500rpm×15min)，弃上清收集细菌，用高压灭菌PBS(pH7.4)重悬菌体，并全部转移到1000ml容量瓶中，将菌悬液高压蒸汽灭菌(121℃，60min)；低温高速离心(4℃，4000rpm×30min)收集上清，将得到的沉淀再次高压蒸汽灭菌(121，60min)并低温高速离心收集上清，将两次得到的上清合并；为防止细菌生长以及过滤残留的细菌，使用0.22um针头滤器过滤上清；在过滤后的液体中加入终浓度为1％的CTAB，充分搅拌后4℃静置过夜；低温高速离心(4℃，11000rpm×10min)CTAB结合物，弃上清收集沉淀物，即为复合多糖；2mol/l氯化钙溶液中溶解复合多糖，充分溶解后低温高速离心(4℃，11000rpm×10min)离心收集上清；向上清溶液中加入两倍体积的80％乙醇，4℃静置2天；低温高速离心(4℃，11000rpm×5min)收集沉淀，即为粗糖。2、精致多糖的提取将收集到的粗糖用无水乙醇洗涤；将溶液溶入饱和乙酸钠中；用酚∶氯仿∶异戊醇体积之比为25∶24∶1的溶液抽提蛋白3次，每次低温高速离心(4℃，11000rpm×10min)收集上清；将上清所得装入透析袋，使用去离子水透析2天，每12h换透析外液1次；取出透析袋内液体，加入两倍体积无水乙醇，4℃静置2天；低温高速离心(4℃本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖疫苗，其特征在于，包含无乳链球菌荚膜多糖与蛋白载体的联合物，其每一单位给药剂量(Administration Dose，TT)的制剂中含有无乳链球菌荚膜多糖(Capsular Polysaccharide，CPS)的量为5μg。
【技术特征摘要】
1.一种罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖疫苗，其特征在于，包含无乳链球菌荚膜多糖与蛋白载体的联合物，其每一单位给药剂量(AdministrationDose，TT)的制剂中含有无乳链球菌荚膜多糖(CapsularPolysaccharide，CPS)的量为5μg。2.权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，其中的蛋白载体选自破伤风类毒素(TetanusToxoi...
【专利技术属性】
技术研发人员：李安兴，李云，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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