一种制备斑马鱼骨质疏松模型的方法及其茜素红染色方法技术

本发明专利技术提供了一种制备斑马鱼骨质疏松模型的方法及其茜素红染色方法。本发明专利技术上述制模方法使用高浓度的Fe

Method for preparing zebrafish osteoporosis model and alizarin red dyeing method thereof

The invention provides a method for preparing a zebrafish osteoporosis model and a alizarin red dyeing method thereof. The inventive method of the invention uses a high concentration of Fe

【技术实现步骤摘要】
一种制备斑马鱼骨质疏松模型的方法及其茜素红染色方法
本专利技术涉及骨质疏松动物模型领域，具体而言，涉及一种制备斑马鱼骨质疏松模型的方法及其茜素红染色方法。
技术介绍
骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织显微结构异常和骨折危险性增加为特征的一类病症。该病症是老年人常见病、多发病，随着人口老龄化进程的加快，骨质疏松症的发病率越来越高。因此，构建有效的骨质疏松筛药模型，对骨质疏松症的药物治疗和发现安全有效的新药具有重要意义。目前，用于制备骨质疏松模型的动物主要有大鼠、小鼠和斑马鱼；由于个体小、生长周期快、饲养和维护成本低，相对于大鼠和小鼠而言，斑马鱼作为骨质疏松模型更具有优势。现阶段，构建斑马鱼骨质疏松模型时主要使用的药物是泼尼松龙和地塞米松，但上述两种药物属于糖皮质激素类药物，在造模时极易因为剂量把握不准而使免疫抑制过强导致斑马鱼胚胎致畸、致死率高。目前还有研究发现，去铁铵或铁调素可修复高铁造成的斑马鱼骨骼发育缺陷，但高铁诱导的幼鱼骨质疏松模型是否能够用于筛选铁螯合剂以外的其他治疗骨质疏松的药物尚未可知。另外，现阶段用于制模的斑马鱼一般选择幼鱼阶段的斑马鱼，与骨质疏松症发病时患者所处的生理阶段(骨质疏松症主要发生在成年尤其是中老年阶段)差异大，不能很好地模拟骨质疏松症。因此，本领域亟待提出一种制备骨质疏松模型的方法，能够快速、高效地制备用于广泛评价和筛选不同种类的治疗骨质疏松药物的模型。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种制备斑马鱼骨质疏松模型的方法，由该方法制备的模型能够用于广谱地筛选各种治疗骨质疏松的药物。本专利技术的第二目的在于提供一种对上述斑马鱼骨质疏松模型进行茜素红染色的方法，该方法能够稳定、高效地对斑马鱼幼鱼进行染色。本专利技术的第三目的在于提供一种对上述斑马鱼骨质疏松模型进行茜素红染色的方法，该方法能够稳定、高效地对斑马鱼成鱼进行染色。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术涉及一种制备斑马鱼骨质疏松模型的方法，所述方法包括用Fe3+溶液处理斑马鱼的步骤，其中，所述溶液中Fe3+的摩尔浓度大于0.8mmol/L。在上述制备方法中，本专利技术使用Fe3+溶液处理斑马鱼。与泼尼松龙和地塞米松的高致畸率和高致死率不同，Fe3+溶液相对温和，用Fe3+溶液、甚至是高浓度的Fe3+溶液处理斑马鱼也基本不会导致斑马鱼致畸或致死。其次，阿仑膦酸钠(不属于铁螯合剂，用于治疗骨质疏松，但作用机制尚不清楚)能够修复由本专利技术上述方法制备而成的骨质疏松模型，表明本专利技术上述方法制备的模型虽然是利用高铁沉积制备而成，但铁螯合剂以外的其他治疗骨质疏松症的阳性药物也能修复该模型，因此，该模型能够广谱地用于筛选各种不同的治疗骨质疏松症的药物。本专利技术上述方法使用高浓度的Fe3+溶液处理斑马鱼，不但显著降低斑马鱼骨骼矿化面积，诱使斑马鱼骨密度显著降低，还引发软骨发育缺陷，降低骨骼调控相关基因Bgp、Sox9b、col1a2和col10ala的表达。因此，与一般骨质疏松模型相比，本专利技术上述方法制备的斑马鱼模型的总骨量损失更多，所具备的骨质疏松的特征更突出、明显。在一些实施方式中，所述溶液中Fe3+的摩尔浓度为0.8～1.2mmol/L，优选1mmol/L。本专利技术上述方法对溶液中Fe3+浓度做出进一步优选，采用该优选的Fe3+溶液能够进一步降低斑马鱼骨骼的硬骨矿化面积、软骨面积以及骨骼调控相关基因Bgp、Sox9b、col1a2和col10ala的表达，使斑马鱼所具备的骨质疏松症状更突出。在一些实施方式中，所述Fe3+溶液包括选自枸橼酸铁铵溶液、FeCl3溶液、硫酸铁铵溶液中的一种或多种，优选地，所述Fe3+溶液为枸橼酸铁铵溶液。在一些实施方式中，所述Fe3+溶液为枸橼酸铁铵溶液，所述枸橼酸铁铵溶液的浓度大于400μg·ml-1，优选为400～600μg·ml-1，特别优选500μg·ml-1。在一些实施方式中，所述斑马鱼为幼鱼。在一些实施方式中，所述斑马鱼为成鱼。本专利技术上述方法选择斑马鱼成鱼为枸橼酸铁铵的处理对象，由于成鱼在进行药物处理时已经发育完全，且活力和抵抗力也高于幼鱼，因此，以成鱼为制模对象能够进一步降低制模过程中斑马鱼的致畸率和致死率。更重要地是，该模型是在骨骼发育完成之后的成年阶段诱导出现骨质疏松的症状，与骨质疏松病症发病时所处的阶段和骨骼状态更为接近，因此，与幼鱼模型相比，本专利技术上述方法制备的成鱼模型能够更好地模拟骨质疏松症，在进行药物筛选时获得更好的筛药效果。在一些实施方式中，所述斑马鱼为三月龄斑马鱼成鱼。在一些实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：将受精后24～72h的幼鱼暴露在Fe3+溶液中培养3～5d；或者，将成鱼暴露在Fe3+溶液中培养10～20d。在一些实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：将受精后48h的幼鱼暴露在Fe3+溶液中培养4d；或者，将成鱼暴露在Fe3+溶液中培养15d，优选地，所述成鱼为三月龄斑马鱼。在一些实施方式中，在将幼鱼暴露在Fe3+溶液中培养的期间，每隔10～14h重新更换Fe3+溶液，优选每隔12h重新更换Fe3+溶液；或者，在将成鱼暴露在Fe3+溶液中培养的期间，每隔18～36h重新更换Fe3+溶液，优选每隔24h重新更换Fe3+溶液。本专利技术还涉及对上述斑马鱼骨质疏松模型进行茜素红染色的方法，所述方法包括以下步骤：(1)用脱色素液脱去斑马鱼骨质疏松模型的色素，所述斑马鱼为斑马鱼幼鱼；(2)用染色工作液对幼鱼进行染色，所述工作液的组分包括茜素红、氢氧化钾、乙醇和水；优选地，所述工作液中茜素红的质量分数为0.003～0.005％，进一步优选为0.004％；氢氧化钾的质量分数为0.5～0.8％，进一步优选0.7％，乙醇的体积分数为0.6～0.8％，进一步优选为0.75％。本专利技术上述茜素红染色方法对传统的斑马鱼幼鱼染色方法进行改进，在染色之前先脱去斑马鱼体内的黑色素和黄色素，使斑马鱼透明化，从而令染色背景更干净；并且本专利技术所述方法用于染色的工作液中含有乙醇和KOH，能够进一步地吸附色素。与传统染色方法相比，本专利技术所述染色方法具备使染色背景更干净、染色效果更稳定的优点。本专利技术上述染色方法还对茜素红、KOH和乙醇的含量进行优化，提高上述工作液对斑马鱼幼鱼骨骼染色的稳定性。在一些实施方式中，上述方法还包括在步骤(1)之后，步骤(2)之前还包括甲醇梯度脱水的操作；优选地，所述甲醇梯度脱水包括将斑马鱼依次置于溶液1、溶液2和溶液3中，其中，溶液1中包括甲醇和含吐温的缓冲液，甲醇的体积分数为20～30％，优选25％，含吐温的缓冲液的体积分数是70～80％，优选75％，所述含吐温的缓冲液优选为PBST或TBST；溶液2中包括甲醇和含吐温的缓冲液，甲醇的体积分数为45～55％，优选50％，含吐温的缓冲液的体积分数是45～55％，优选50％，所述含吐温的缓冲液优选为PBST或TBST；溶液3为100％甲醇溶液。在一些实施方式中，所述方法还包括在甲醇梯度脱水后将斑马鱼幼鱼置于含DMSO和甲醇的溶液中，其中，DMSO的体积分数为15～25％，优选20％，甲醇的体积分数为75～85％，优选85％。在本专利技术的上述方法中，使用含吐温的甲醇溶液进行梯度脱水，并将脱水后的幼鱼置于含D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备斑马鱼骨质疏松模型的方法，其特征在于，所述方法包括用Fe

【技术特征摘要】
1.一种制备斑马鱼骨质疏松模型的方法，其特征在于，所述方法包括用Fe3+溶液处理斑马鱼的步骤，其中，所述溶液中Fe3+的摩尔浓度大于0.8mmol/L。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液中Fe3+的摩尔浓度为0.8～1.2mmol/L，优选1mmol/L。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述Fe3+溶液包括选自枸橼酸铁铵溶液、FeCl3溶液、硫酸铁铵溶液中的一种或多种，优选地，所述Fe3+溶液为枸橼酸铁铵溶液。4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述斑马鱼为幼鱼或成鱼。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：将受精后24～72h的幼鱼暴露在Fe3+溶液中培养3～5d；或者，将成鱼暴露在Fe3+溶液中培养10～20d。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：将受精后48h的幼鱼暴露在Fe3+溶液中培养4d；或者，将成鱼暴露在Fe3+溶液中培养15d，优选地，所述成鱼为三月龄斑马鱼。7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，在将幼鱼暴露在Fe3+溶液中培养的期间，每隔10～14h重新更换Fe3+溶液，优选每隔12h重新更换Fe3+溶液；或者，在将成鱼暴露在Fe3+溶液中...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛钰，潘裕添，张文娟，许璟瑾，李秀敏，
申请(专利权)人：闽南师范大学，
类型：发明
国别省市：福建,35