基于一体三步法的龙脑樟再生体系的快速建立方法技术

本发明专利技术提供基于一体三步法的龙脑樟再生体系的快速建立方法，取龙脑樟当年生半木质化无病虫害的枝条，去其叶片，剪成具有4～6个腋芽的茎段作为外植体，将其经过表面消毒后通过一体三步法培养，最终获得龙脑樟组培苗。本发明专利技术提供了一种以多节间的茎段作为外植体，采用研究出的独特配方使其在较短培养时间内，通过改变不同的环境来快速的完成龙脑樟诱导的全过程，从而培育出龙脑樟组织培养苗木的方法。本方法即保存了种苗性状的稳定性，又缩短了苗木诱导繁殖的时间，为龙脑樟母本优良品质的保存提供了一种方法。

Rapid establishment method of camphor camphor regeneration system based on integrated three step method

The invention provides a method for quickly building one of the three step regeneration system based on borneol, borneol from semi lignified branches to no pests, its leaves, cut into 4 to 6 stems with axillary buds as explants, the surface sterilized by three after one step method of training, the final get seedlings of Cinnamomum camphora. The invention relates to a multi internode stem segment as explant, a unique formula of the culture in a relatively short time, by changing the environment to quickly complete the whole process of borneol induced, to develop a method of tissue culture seedlings of Cinnamomum camphora. The method preserves the stability of seedling characters, shortens the time for inducing propagation of seedlings, and provides a method for preserving the superior quality of the female parent of borneol.

【技术实现步骤摘要】
基于一体三步法的龙脑樟再生体系的快速建立方法
本专利技术属于植物栽培领域，具体涉及基于一体三步法的龙脑樟再生体系的快速建立方法。
技术介绍
龙脑樟属樟科(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)亚热带阔叶林植物，樟科植物多含有龙脑。樟科植物资源非常丰富，我国约有46种和1变种，根据其精油组成成分及含量的差异，樟树可分为5个化学类型即脑樟、芳樟、油樟、异樟、龙脑樟，同一种内可分为几个不同的化学型，其中龙脑樟则是种特异类型，它是由樟树自然授粉群体中发现的。龙脑樟的叶片富含精油，含油率为2%左右，叶部精油的主要成分右旋龙脑（天然冰片）最高含量为87%，这是到目前为止从植物中提取冰片得率最高的。天然冰片(Borneolum)又名龙脑、龙脑香、梅花冰片、梅花脑等，是一种中医常用的名贵珍稀药材和高级香料，具有开窍醒神、清热止痛等功效，配制中成药的重要药物，也是日用化工和食品工业中的高档添加剂。主产于印度尼西亚、菲律宾、印度、马来西亚，我国历来依靠进口来满足需要，最近这几年的天然冰片资源缺乏，大多采用天然合成。由江西吉安市林科天然冰片厂生产的天然冰片已列入2005版、2010版和2015版的《中华人民共和国药典》标准，并使《药典》中冰片增加为3种，其中冰片为合成龙脑（机制冰片），艾片为左旋龙脑，天然冰片为右旋龙脑。因此，利用樟树龙脑樟的树叶来生产天然右旋龙脑,是目前我国最佳天然植物资源。繁育栽培方面：目前多采用常规的种子繁殖或扦插繁育，显然难以避免受到繁殖率低且易出现性状分离、母树的优良性状难以保持、扦插繁育易受母树枝条数和栽培环境等的限制。自然环境下通过种子繁育的龙脑樟子代约有20～60%不发生变异，且龙脑樟的种子数量少，因而分类培育和经营必须在苗期进行分类剔除其它类型的苗木。从鲜叶中提取精油，不同的个体间其含量和主要成分不同，差异程度可达50%以上，不利于用来提纯，不能作为天然冰片资源进行培育；而有些优良个体鲜叶精油右旋龙脑含量达91%，樟脑含量不到1%。因此，要选择优良的母树必须要先营造优质龙脑樟原料林。此类方法耗时长久、工作量巨大、投入成本与产出存在较大的违背性，不适宜繁殖龙脑樟苗木。利用龙脑樟叶片右旋龙脑含量高及樟树萌发能力强的特性，研究培育鲜枝叶，利用鲜枝叶加工生产天然冰片。江西吉安市林业科学研究所开展了龙脑樟扦插育苗方法；修剪龙脑樟穗条长6～8公分，将底部平剪，顶部留一片叶或半片叶，消毒后浸泡在生根粉营养液中；选取酸性土壤进行松土、杀菌、施肥，浇水，并清理掉周围的阳光遮挡物；在晴天低温下，将穗条扦插入土中，叶片朝同一方向着齐，芽苞置于土壤表层一公分，每株行距及株距为5公分；扦插后再次给龙脑樟穗条消毒，喷生根粉营养液，浇水，并插上竹片盖上白色薄膜给其进行密封，保证其中的湿度达标；盖上遮阴率为80%以上的遮阴网，四周边固定，封垅后至少30天不得揭开遮阴网及其白色薄膜。本方法采用扦插繁殖的育苗方法进行龙脑樟优良类型苗木繁殖，具有繁殖时间为4～6个月、种苗纯度高、成活率最高可达50%，同时病虫害多、死亡率高，也影响着苗木的质量。以上两种方法的缺点显著，不能满足大量引种繁殖的需要。在专利“一种龙脑樟组织培养方法（申请号：201510180211）”中，于每年4～5月份取龙脑樟当年新抽半木质化枝条，剪取具有2～3个叶片的枝条，去除叶片后，置于无菌水中振荡洗涤3～5分钟，再用70%的酒精处理1～2分钟，置于0.1%升汞6～10分钟，再用无菌水清洗3次；将处理的半木质化枝条接种到不定芽诱导培养基中，获得无菌外植体，光照培养条件下培养后，形成用于扩繁的愈伤组织和不定芽；再经过继代增殖扩繁培养基、诱导生根培养基的培养，培育得到生根苗；将经以上培养的龙脑樟生根苗移栽，成活率95%以上。此方法不仅需要多次更换不同类型培养基，而且需要较长时间（4～5个月）才可获得完整苗木。本专利技术针对以上等现有组织培养技术所存在的问题，利用带腋芽的茎段作为外植体，经过表面消毒、一体三步法培养，最终在较短时间（1.5～2个月）内获得大量的龙脑樟组培苗。使用自主研发配制的一体三步法培养基一次性便可诱导出完整的龙脑樟苗木。在与传统组织培养技术获得同等繁殖倍数的苗木的前提下，即节省了药品、人工、劳动力等成本，又缩短了培养时间，提高了组织培养效率。这种龙脑樟组织培养技术即保存了苗木的优质性，繁殖出大量具有保持母本优良品质的龙脑樟植株，又满足引种推广的需求；与常规种子繁殖、扦插、组培繁殖等繁殖技术相比，此法有效地提高龙脑樟的繁殖效率，保持了母本的优良性状，不易产生性状变异。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于一体三步法的龙脑樟再生体系的快速建立方法，该方法不仅提高了龙脑樟的繁殖倍数，缩短生长周期，提高繁殖系数，而且增加了根系活力，提高了组培成苗的质量，为龙脑樟组培快繁研究提供了一种思路、方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：取龙脑樟当年生半木质化无病虫害的枝条，去其叶片，剪成具有4～6个腋芽的茎段作为外植体，将其经过表面消毒后用一体三步法培养，最终获得完整龙脑樟组培苗。所述方法具体包括以下步骤：(1)表面消毒：选取龙脑樟当年生半木质化无病虫害的枝条，去其叶片，剪成具有3～8个节间的长茎段作为外植体，用软毛刷轻刷表皮泥土及粉尘，进行表面消毒处理后，将其切成0.3～1cm带节间的单茎段备用；(2)一体三步法培养：将经过(1)处理的外植体接种入培养基A中，外植体按其原植株生长方向竖插于培养基中，在环境Ⅰ中培养7d后诱导出芽点，15d后诱导出0.8～1.5cm丛生芽；将丛生芽按单芽分割开之后接种至培养基B中，移入环境Ⅱ中生长15d后，诱导出不定根；之后再将其更换入环境Ⅲ中，培养20～30d后，当苗高长至2.5～4cm后，准备炼苗、移栽；(3)炼苗：将经过（2）中培养的瓶苗从培养室取出放置常规室内1～2天，第3天将瓶盖打开后继续放置1～3天，期间每天要补充10～15ml无菌水至瓶内，此后将培育出的组培苗夹出，洗净根部培养基，准备移栽；(4)移栽：用800ppm多菌灵溶液将洗净根部培养基的龙脑樟组培苗浸泡30min后，取出，用稀黄土水沾根后，移栽入酸性土壤的移植袋中生长，待苗木长至6～8cm后，再将其移栽入酸性土壤的栽培基质中定植，成活率达98%以上；(5)田间栽培管理：将幼苗移栽田间，环境温度15～28℃，喷雾保湿，保持空气湿度70～85%，覆盖遮阴率80%遮阳网，每周喷洒1次杀菌剂，每半月施一次氮、磷、钾复合肥。步骤（1）中表面消毒处理为在含体积浓度为0.1～0.2%洗洁精的水中浸泡30min后，流动的水冲洗2～3h，置于超净工作台上用70wt.%酒精消毒10～30s，无菌水冲洗3～5次，再用0.1wt.%升汞消毒10～20min，无菌水冲洗3～5次后，用无菌滤纸吸干外植体表面的水分。培养基A配方为：改良MS+6BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，pH值为5.8；所述改良MS为MS基本培养基中仅硝酸铵成分减为825mg/L，其它成分不变。培养基B配方为：1/2改良MS+IBA0.3mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭1g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，pH值为5.8；所述改良MS为MS基本本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于一体三步法的龙脑樟再生体系的快速建立方法，其特征在于：取龙脑樟当年生半木质化无病虫害的枝条，去其叶片，剪成具有4～6个腋芽的茎段作为外植体，将其经过表面消毒后用一体三步法培养，最终获得完整龙脑樟组培苗。

【技术特征摘要】
1.基于一体三步法的龙脑樟再生体系的快速建立方法，其特征在于：取龙脑樟当年生半木质化无病虫害的枝条，去其叶片，剪成具有4～6个腋芽的茎段作为外植体，将其经过表面消毒后用一体三步法培养，最终获得完整龙脑樟组培苗。2.根据权利要求1所述的基于一体三步法的龙脑樟再生体系的快速建立方法，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤：(1)表面消毒：选取龙脑樟当年生半木质化无病虫害的枝条，去其叶片，剪成具有3～8个节间的长茎段作为外植体，用软毛刷轻刷表皮泥土及粉尘，进行表面消毒处理后，将其切成0.3～1cm带节间的单茎段备用；(2)一体三步法培养：将经过(1)处理的外植体接种入培养基A中，外植体按其原植株生长方向竖插于培养基中，在环境Ⅰ中培养7d后诱导出芽点，15d后诱导出0.8～1.5cm丛生芽；将丛生芽按单芽分割开之后接种至培养基B中，移入环境Ⅱ中生长15d后，诱导出不定根；之后再将其更换入环境Ⅲ中，培养20～30d后，当苗高长至2.5～4cm后，准备炼苗、移栽；(3)炼苗：将经过（2）中培养的瓶苗从培养室取出放置常规室内1～2天，第3天将瓶盖打开后继续放置1～3天，期间每天要补充10～15ml无菌水至瓶内，此后将培育出的组培苗夹出，洗净根部培养基，准备移栽；(4)移栽：用800ppm多菌灵溶液将洗净根部培养基的龙脑樟组培苗浸泡30min后，取出，用稀黄土水沾根后，移栽入酸性土壤的移植袋中生长，待苗木长至6～8cm后，再将其移栽入酸性土壤的栽培基质中定植，成活率达98%以上；(5)田间栽培管理：将幼苗移栽田间，环境温度15～28℃，喷雾保湿，保持空气湿度70～85%，覆盖遮阴率80%遮阳网，每周...

【专利技术属性】
技术研发人员：张杭颖，张君诚，
申请(专利权)人：三明学院，
类型：发明
国别省市：福建,35