一种高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法技术

本发明专利技术公开了一种高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法，包括胚性愈伤组织的诱导、增殖，体细胞胚的成熟、萌发和转化；所述的体细胞胚的成熟培养采用液—固增殖‑固成熟方式进行。本发明专利技术的高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法，以抗松材线虫病赤松的未成熟合子胚为外植体，通过对抗病赤松未成熟合子胚已成功诱导获得的胚性愈伤组织进行体细胞胚成熟、萌发与植株再生等试验，成功获得了成熟的体细胞胚和再生植株，并移栽成活，在成熟培养基上产生体细胞胚的萌发率和植株转化率高，分别为67.2%和46.5%，为抗病赤松的大规模繁殖和工厂化生产提供了重要的科学依据和技术支撑。

High synchronization method for somatic embryogenesis and plant regeneration of pine wood nematode resistant pine wood disease

The invention discloses a method and plant regeneration of pine wood nematode of pine somatic embryos in a high synchronization occurs, including the induction and proliferation of embryogenic callus, somatic embryo maturation, germination and conversion of somatic embryos; the maturation of the liquid solid solid mature way of proliferation. Method and plant regeneration of pine wood nematode of pine somatic embryo high synchronization of the invention to the occurrence of pine pine wood nematode of immature zygotic embryos as explants, the disease resistant pine has been successfully induced from immature zygotic embryos of embryogenic callus to somatic embryo maturation, germination and plant regeneration test. Success of the mature somatic embryos and regenerated plants, and the transplanting survival, maturation of somatic embryos produced in plants based on the germination rate and high conversion rate, respectively 67.2% and 46.5%, to provide a scientific basis and technical support for the large-scale breeding and disease resistant pine factory production.

【技术实现步骤摘要】
一种高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法
本专利技术属于树木育种
，具体涉及一种高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法。
技术介绍
赤松(Pinusdensiflora)，主要分布于日本、朝鲜、俄罗斯东南部及我国东部，可作庭院、荒山造林的树种，但易感染松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)而大量死亡，对林业生产和生态环境造成了严重破坏。由于常规种苗繁殖系数低，选育出的抗病材料难以满足大规模林业生产的需求。为了大量快速繁殖已选优良抗病基因型，在短时间内实现规模化生产，对赤松离体组织培养技术的研究显得尤为重要。体细胞胚胎发生具有繁殖系数大、周期短、结构完整、再生率高、不受季节影响等特点(Guptaetal,1993)，是植物大规模无性繁殖的一种主要手段(汪小雄等，2006；StasollaandYeung,2003)。国内外学者已通过体细胞胚胎发生成功获得50多种针叶树体细胞胚或体细胞胚再生植株(孙志强等，2010)，其中火炬松(Pinustaeda)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)和辐射松(Pinusradiata)等树种体细胞胚发生已经应用于规模化生产(张守攻，2004)。Taniguchi(2001)首次对日本赤松体细胞胚胎发生进行研究，建立了胚性细胞系和进行体细胞胚胎成熟试验，但转化率非常低；随后，Maruyama等(2005)、Maruyama和Hosoi(2012)、Shoji等(2006)、Kim等(2014)研究了赤松胚性愈伤组织增殖、体细胞胚胎成熟、萌发及转化的影响因子，但存在胚性愈伤组织诱导率低、胚性愈伤组织能力的丧失，体胚成熟与转化率低等问题。而国内外目前对赤松组织培养器官发生植株再生有所研究(朱丽华等，2010；李清清，2012)。目前国内关于赤松体细胞胚胎发生的研究报道很少(吴静等，2015)。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法，为抗病赤松体细胞胚胎发生条件进行优化以提高其体细胞胚胎的质量和数量，从而来提高萌发率和植株转化率，为抗性赤松的种质资源保存、基因转化、体胚苗的工厂化生产提供可行的技术支撑。技术方案：为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法，包括胚性愈伤组织的诱导、增殖，体细胞胚的成熟、萌发和转化；所述的体细胞胚的成熟培养采用液—固增殖-固成熟方式进行。所述的液—固增殖-固成熟为：取生长良好的胚性愈伤组织，转入不含激素的DCR液体培养基中，剧烈震荡形成良好的悬浮体系，取培养好的悬浮液，均匀分散在灭菌后的滤纸上，用脱脂棉吸取水分，待水分沥干后，将有培养物的滤纸放入配制好的固体增殖培养基中，15天之后转入固体成熟培养基中。所述的体细胞胚的萌发为：将诱导的成熟体细胞胚22#-1水平置于萌发培养基上进行萌发，萌发培养基为LP，添加20g/L麦芽糖，2g/LAC，3g/L植物凝胶，pH5.8；非直射光培养4-7天，再放入直射光下培养14-17天；然后将萌发的体细胞胚转入WPM基本培养基，附加1.5mg/LIBA，0.2mg/LNAA，15g/L蔗糖，0.1g/L肌醇，7g/L卡拉胶，光照培养1个月。所述的体细胞胚的转化为：待再生植株根伸长2cm后进行移栽，移栽前7d逐渐将封口膜揭开，使幼苗适应外界的环境，移栽时将幼苗根部的卡拉胶小心洗掉，移栽在珍珠岩、苗圃土和河沙构成1：1：2的基质中，移苗一个月内注意保持空气湿度、温度和基质湿度的稳定，3个月后移栽成活。在所述的体细胞胚的成熟培养中，培养基中添加15mg/LABA和140g/LPEG8000。在所述的体细胞胚的成熟培养中，培养基中添加8g/L肌醇。在所述的体细胞胚的成熟培养中，培养基中添加60g/L麦芽糖。在所述的体细胞胚的成熟培养中，培养基中添加3g/L植物凝胶。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法，以抗松材线虫病赤松的未成熟合子胚为外植体，通过对抗病赤松未成熟合子胚已成功诱导获得的胚性愈伤组织进行体细胞胚成熟、萌发与植株再生等试验，成功获得了成熟的体细胞胚和再生植株，并移栽成活，在成熟培养基上产生体细胞胚的萌发率和植株转化率高，分别为67.2％和46.5％，再生植株3个月移栽成活率为32.7％。为抗病赤松的大规模繁殖和工厂化生产提供了重要的科学依据，为抗性赤松的种质资源保存、基因转化、体胚苗的工厂化生产提供可行的技术支撑。附图说明图1是不同糖类对抗病赤松体细胞胚成熟的影响结果图；图2是肌醇浓度对抗病赤松体细胞胚成熟的影响结果图；图中：J1为肌醇0g/L，J2为肌醇2g/L，J3为肌醇4g/L，J4为肌醇6g/L，J5为肌醇8g/L，J6为10g/L，J7为肌醇16g/L；图3是抗病赤松体细胞胚胎成熟、萌发及植株再生结果图；图中，A1，A2：正常子叶胚；B1，B2：畸形子叶胚；C1；C2：萌发培养基中5d后的体细胞胚；C3：萌发培养基中20d后体细胞胚形成的再生植株；D1，D2：WPM培养基中壮苗的再生植株；E1，E2：WPM培养基中壮苗1个月的再生植株；F1，F2：WPM培养基中壮苗3个月的再生植株；G1：移栽后体细胞胚苗；G2：移栽后3个月体细胞胚苗。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。以下实施例所使用的材料为：抗病赤松未成熟球果于2013年6月采集于江苏句容林场抗松材线虫病赤松种质资源库(2004年2月从日本林木良种繁育中心引种建立)，从球果中剥离出未成熟合子胚，诱导出具有胚性的愈伤组织(22#-1和13#-1)，并已继代培养7次，再经过3次继代培养，将胚性愈伤组织生长状况良好的两个无性系22#-1和13#-1作为体细胞胚胎发生的材料(吴静，朱丽华，许建秀，吴小芹，叶建仁.抗松材线虫病赤松胚性愈伤组织的诱导及增殖.南京林业大学学报，2015，39(1)：17-21)。以下实施例的结果数据采用Excel2007处理，用SPSS17.0软件进行方差分析和差异显著性检验。实施例1ABA浓度(10、15、20mg/L)、PEG(聚乙二醇)8000浓度(100、140、180g/L)进行两因素随机区组试验。将22#-1的胚性胚柄团(embryonicsuspensormass，ESM)转接至设计的培养基(基本培养基LP，另附加肌醇8g/L，麦芽糖60g/L，MES250mg/L，CH500mg/L，VC10mg/L，谷氨酰胺450mg/L，活性炭(AC)2.0g/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)中，每处理30块ESM，重复3次，实时观察体胚的成熟情况。培养基。培养基用高压灭菌121℃20min。抗病赤松体细胞胚胎诱导、增殖和成熟试验在培养温度设定为23±2℃的组培室中，暗培养，每两个星期观察一次。正常体细胞胚数即每克愈伤组织形成体细胞胚数(个/g)＝正常体细胞胚个数/愈伤组织鲜质量，畸形体细胞胚数即每克愈伤组织形成体细胞胚数(个/g)＝畸形体细胞胚个数/愈伤组织鲜质量，体细胞胚数即每克愈伤组织形成体细胞胚数(个/g)＝体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法，包括胚性愈伤组织的诱导、增殖，体细胞胚的成熟、萌发和转化；其特征在于：所述的体细胞胚的成熟培养采用液—固增殖‑固成熟方式进行。

【技术特征摘要】
1.一种高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法，包括胚性愈伤组织的诱导、增殖，体细胞胚的成熟、萌发和转化；其特征在于：所述的体细胞胚的成熟培养采用液—固增殖-固成熟方式进行。2.根据权利要求1所述的高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法，其特征在于：所述的液—固增殖-固成熟为：取生长良好的胚性愈伤组织，转入不含激素的DCR液体培养基中，剧烈震荡形成良好的悬浮体系，取培养好的悬浮液，均匀分散在灭菌后的滤纸上，用脱脂棉吸取水分，待水分沥干后，将有培养物的滤纸放入配制好的固体增殖培养基中，15天之后转入固体成熟培养基中。3.根据权利要求1所述的高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法，其特征在于：所述的体细胞胚的萌发为：将诱导的成熟体细胞胚22#-1水平置于萌发培养基上进行萌发，萌发培养基为LP，添加20g/L麦芽糖，2g/LAC，3g/L植物凝胶，pH5.8；非直射光培养4-7天，再放入直射光下培养14-17天；然后将萌发的体细胞胚转入WPM基本培养基，附加1.5mg/LIBA，0.2mg/LNAA，15g/L蔗糖，0.1g/L肌醇，7g/L卡拉胶...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴小芹，许建秀，叶建仁，吴静，朱丽华，潘珺，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32