GCSF缀合物制造技术

本发明专利技术描述了具有式（Ⅰ）的生理学活性ＰＥＧ－ＧＣＳＦ缀合物，以及含有各种缀合物的混合物的组合物，其中在所述组合物中对于所述缀合物ｍ和ｎ可以为不同的整数。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
粒细胞集落刺激因子(GCSF)是一种药学上的活性蛋白，所述蛋白调节嗜中性粒细胞的增殖、分化和机能的激活(Metcalf，Blood 67257(1986)；Yan等，Blood 84(3)795-799(1994)；Bensinger等，Blood 81(11)3158-3163(1993)；Roberts等，Expt’l Hematology 221156-1163(1994)；Neben等，Blood 81(7)1960-1967(1993))。GCSF可以使干细胞和前体细胞从骨髓转移(mobilization)，并且用于治疗由于化学疗法引起的粒细胞减少的患者，或用作骨髓移植的前序。美国专利第5,214,132号公开了一种人GCSF的突变蛋白，所述突变蛋白在位置1、3、4、5和17不同于天然hGCSF，所述突变蛋白的所述位置不是天然GCSF的氨基酸，而分别是Ala、Thr、Tyr、Arg和Ser。(也参见，Kuga等，Biochem.Biophys.Res.Commun.159103-111(1989))。M.Okabe等(Blood 75(9)1788-1793(1990年5月1日))报道了一种rhGCSF的衍生物，其中在rhGCSF N端区的5个位置上的氨基酸被取代，在两种测定中，所述rhGCSF衍生物显示比小鼠和/或人骨髓祖细胞中的完整rhGCSF的比活高。美国专利第5,218,092号公开了一种人GCSF的突变蛋白，所述突变蛋白在位置1、3、4、5、17、145和147不同于天然hGCSF，所述突变蛋白的所述位置不是天然GCSF的氨基酸，而分别是Ala、Thr、Tyr、Arg、Ser、Asn和Ser。美国专利第5,214,132和5,218,092号的公开内容通过引用结合到本文中。蛋白治疗药物例如GCSF的生物利用度通常受血浆半寿期短的限制，并且对蛋白酶降解敏感，阻碍了最大的临床潜能。其它治疗蛋白的研究已经表明，通过使蛋白与聚合物例如聚乙二醇(PEG)缀合，通常一个与通过蛋白和PEG两者共价结合的连接部分缀合，可以克服这样的困难。这种PEG缀合的生物分子已经显示具有临床上的可应用特性(Inada等，J.Bioact.and Compatible Polymers，5343(1990)；Delgado等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，9249(1992)；和Katre，Advanced Drug Delivery Systems，1091(1993))。在这些特性中有更好的物理和热稳定性、针对酶降解敏感性的保护作用、溶解度增加、使体内循环半寿期更长和清除率减少、降低免疫原性和抗原性以及降低毒性。具有与本专利技术缀合物的结构不同的PEG-GCSF缀合物公开于欧洲专利公布号EP 0 335 423；欧洲专利公布号EP 0 401 384；R.W.Niven等，J.Controlled Release 32177-189(1994)；和Satake-Ishikawa等，Cell Structure and Function，17157-160(1992))。专利技术概述因此，本专利技术是一类新型的GCSF的PEG衍生物。本专利技术的缀合物具有一个可以参见下文的酰胺连接物。与未修饰的GCSF(即没有连接PEG的GCSF)比较，本缀合物的循环半寿期和血浆滞留期增加、清除率减少以及体内粒细胞生成活性增加。另外，与PEG-GCSF缀合物比较，本专利技术的缀合物具有优良的粒细胞生成特性。其它PEG-GCSF缀合物公开于欧洲专利公布号EP 0335 423；欧洲专利公布号EP 0 401 384；以及载于Niven等(出处同上)中。然而，本专利技术缀合物的结构不同于这些缀合物，并且具有优良的特性，尤其在体内低剂量时表现出长期、高粒细胞生成活性。本专利技术的一个优选的GCSF是一种GCSF突变蛋白，所述突变蛋白的特性等同于或优于天然GCSF，并且与GCSF的用途相同。所述突变蛋白与GCSF的氨基酸序列相同，只是所述突变蛋白在位置1、3、4、5和17的氨基酸不是天然GCSF氨基酸，而分别是Ala、Thr、Tyr、Arg和Ser(GCSF突变蛋白)(参见附图说明图1)。该突变蛋白公开于美国专利第5,214,132号，该专利通过引用结合到本文中。本专利技术生理学活性PEG-GCSF缀合物的结构式如下 本专利技术的另一部分是要求保护的缀合物的组合物，其中对于所述组合物中的缀合物而言，m和n可以为不同的整数。本专利技术缀合物的用途与GCSF相同。具体来说，本专利技术的缀合物可用于治疗由于化学疗法引起的粒细胞已减少的患者或用作骨髓移植的前序，其方式与用GCSF治疗这些病症的方式相同。然而，本专利技术的缀合物具有包括优良的稳定性、更高的溶解度、循环半寿期和血浆滞留期增加在内的改良的特性。附图的描述图1GCSF突变蛋白的一级结构所示的GCSF突变蛋白在位置1、3、4、5和17上不同于野生型人GCSF，所述突变蛋白在所述位置上不是天然GCSF氨基酸，而分别是Ala、Thr、Tyr、Arg和Ser。图2PEG化(Pegylation)试剂图320kDa PEG修饰的和未修饰的GCSF突变蛋白的分离。PEG反应混合物的一种典型洗脱图。柱子1-2ml FractogelEMD SO3650S。平衡缓冲液10mM乙酸铵，pH 4.5洗脱缓冲液1. 0.15M NaCl的平衡缓冲液2. 0.5M NaCl的平衡缓冲液图4单次注射后第5天的PEG-GCSF突变蛋白活性给雌性C57BL/6J小鼠皮下注射25.2μg PEG化GCSF突变蛋白缀合物；在给药后的第5天，从眶后窦中收集静脉血样品。进行计数器血液学分析和白细胞分类分析(leukocyte differentialanalysis)；将所得到的嗜中性粒细胞计数相对于每个实验的载体对照标准化。所示数据代表每组4只小鼠的平均值±S.E.。图5 在酰胺和脲连接的GCSF突变蛋白-PEG缀合物中随PEG质量(kDa)而变化的PMN的增加。对于用SPA试剂制备的缀合物，PMN＝0.277MW+3.95。对于用脲试剂制备的缀合物，PMN＝0.152MW+2.74。图6 单次注射后第7天的PEG-GCSF突变蛋白活性给雌性C57BL/6J小鼠皮下注射25.2μg PEG化的GCSF突变蛋白缀合物；在给药后的第7天，收集眶后静脉血样品。进行计数器血液学分析和白细胞分类分析；将所得到的嗜中性粒细胞计数相对于每个实验的载体对照标准化。所示数据代表每组4只小鼠的平均值±S.E.。图7 鼠PBSC转移集落测定图8 鼠PBSC转移集落测定图9 鼠PBSC转移集落测定图10鼠PBSC转移集落测定图11鼠PBSC转移集落测定专利技术详述要求保护的专利技术是一种具有下式结构的生理学活性PEG-GCSF缀合物 其中G是一种粒细胞集落刺激因子，其参与如式I中所示的聚乙二醇部分的酰胺键的氨基较少，R为低碳烷基，n为420-550的整数，而m为1-5的整数。选择n和m的数目，使得所产生的式I缀合物的生理学活性和未修饰的GCSF相当，所述活性可以表示与未修饰GCSF的相应活性相同、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有下式的生理学活性缀合物：［ＲＯ（ＣＨ↓［２］ＣＨ↓［２］Ｏ）↓［ｎ］ＣＨ↓［２］ＣＨ↓［２］－＊－ＮＨ－］↓［ｍ］－Ｇ Ⅰ其中Ｇ是一种粒细胞集落刺激因子，并且其与所述缀合物中的一个聚乙二醇部分形成一个酰胺键的氨基较少；Ｒ为低 碳烷基；ｎ为４２０－５５０的整数；而ｍ为１－５的整数。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：PS拜伦，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]