突变的人CD80及其制备和应用组合物和方法技术

本发明专利技术公开了改良的疫苗及其使用方法。还公开了用于治疗自身免疫病或移植排斥反应的免疫抑制组合物以及这种组合物的使用方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫个体的组合物和方法。本专利技术涉及免疫抑制组合物、其组分以及其制备和使用方法。CD28是在大多数成熟T细胞和胸腺细胞中组成性表达的一种细胞表面糖蛋白。CTLA-4受体仅在活化后48-72小时的T细胞中可测得，而在静息T细胞中不存在。CD28/CTLA-4分子的主要配体是表达于专门的抗原呈递细胞(APC)表面的B7.1(CD80)和B7.2(CD86)。目前对于存在至少两种受体(CD28和CTLA-4)及两种配体(CD86和CD80)的生物学原理尚不清楚。最初认为CD86和CD80抗原在功能上是相似的。但对于这两种共刺激分子不同表达方式的了解暗示了不同功能的存在。CD86在APC上组成性表达。APC活化后，CD86的表达快速上升，接着渐渐降低到基线水平。CD80的表达比CD86延迟，并且在免疫应答启始48-72小时内达到最大。CD86的组成性表达以及正调节早于CD80，这暗示，在免疫的早期应答中，CD86发挥了更大的作用，而CD80在后期更为重要。具有CD28和CTLA-4的共刺激分子的结合动力学数据进一步揭示了CD86和CD80的功能差异。表面胞质团共振分析表明，这两种配体与CTLA-4的结合亲和力均高于与CD28的结合亲和力。进一步的研究揭示，CD86/CTLA-4复合物的解离速度比CD80/CTLA-4的解离速度快。这种亲和力的差异，以及表达CTLA-4和CD80时同样的延迟暗示，CTLA-4和CD80比CTLA-4和CD86分子间的关系更强。CD86和CD80在体内、体外实验中表现出功能的多样性。抗CD86而非抗CD80的抗体阻止了自身免疫性糖尿病小鼠的疾病发展，但对实验的过敏性脑脊髓炎小鼠有相反的效果。几个实验系统都证明CD86对于引发T细胞对抗源的反应有重要作用。并且，CD80也可能对这些细胞提供调节信号。还发现，在含有HIV-I包膜蛋白的DNA免疫后人外源CD86的表达产生对小鼠T细胞的重要激活信号，但CD80的表达没有同样的效应。编码HIV-I或流感抗原的基因与编码小鼠CD80和CD86的质粒免疫小鼠，也有同样的现象。因此，认为CD86和CD80的功能差异与小鼠体内表达的人共刺激分子不同的免疫原性无关。可以认为是外源的人或小鼠的CD86，刺激了DNA免疫中的抗病毒T细胞的活化。同样产生的CD80没有这种效果。疫苗可用于使个体对靶抗原产生免疫，所述靶抗原例如为病原体抗原或与涉及人类疾病的细胞相关联的抗原。参与人类疾病的细胞相关抗原包括与癌症相关的肿瘤抗原和涉及自身免疫病的细胞相关抗原。在设计这些疫苗时认识到，在接种了疫苗的个体中产生靶抗原的疫苗可有效诱导免疫系统的细胞臂。具体而言，减毒的活疫苗、使用无毒载体的重组疫苗和DNA疫苗均导致抗原在接种了疫苗的个体的细胞中产生，由此诱导免疫系统中的细胞免疫。另一方面，只包括蛋白和诱导体液应答的死疫苗或灭活疫苗的亚单位疫苗，不诱导良好的细胞免疫应答。对于提供抗病原体感染保护，和提供有效用于治疗病原体感染、癌症或自身免疫病的免疫介导疗法，细胞免疫应答常常是必须的。因此，在接种了疫苗的个体中产生靶抗原的疫苗是优选的，例如减毒的活疫苗、使用无毒载体的重组疫苗和DNA疫苗。尽管这些疫苗对于预防性或治疗性地使个体免患病原体感染或人类疾病常常是有效的，但改良的疫苗仍是需要的。产生增强的免疫应答的组合物和方法也是需要的。基因治疗与免疫不同，采用编码非免疫原性蛋白的核酸分子。这种核酸分子的表达在其给予的个体中有良好的疗效。一种具体类型的基因治疗涉及将编码调控个体免疫应答的非免疫原性蛋白的基因给予个体，发挥疗效。例如，可以设计将对与自身免疫病相关的免疫应答有负调节作用的非免疫原性蛋白的基因导入个体以获得疗效。因此，用于调节免疫应答的基因治疗组合物及其制备和使用方法是需要的。也可以考虑用其他方式调节免疫应答，治疗诸如自身免疫病和细胞、组织、器官的移植物排斥反应。对于可用于调节免疫应答的组合物及方法，以及设计和发现这种用于调节免疫应答的组合物有需要。图2A和2B显示在表明各种基因构建体诱导淋巴因子产生的实施例中所述实验结果。图3显示了在表明在各种基因构建体的给予后的CTL活性的实施例中所述实验的数据。图4显示了在表明去除细胞群后测量后的在各种基因构建体的给予后的CTL活性的实施例中所述实验的数据。图5是显示了在表明各种基因构建体免疫的小鼠中产生淋巴细胞对肌肉组织的浸润的实施例中所述实验的照片。图6为CD80分子的图示。本专利技术优选实施方案的说明申请者发现，人CD80的C区负责在抗原呈递细胞(APC)和T细胞的相互作用中传递负信号。负信号降低了T细胞的活性，并降低了针对APC呈递到T细胞上的抗原的免疫应答。具体而言，T细胞上的T细胞受体(TCR)与APC上由组织相容性复合体与抗原形成的MHC/抗原复合体相互作用，伴随着APC上共刺激分子CD80和CD86与T细胞上的CD28分子的相互作用。这种相互作用导致了T细胞的活化和免疫应答的增强。但是，T细胞活化后表达CTLA-4，CTLA-4与CD80分子相互作用产生主导性的负信号，进而排除了前一阶段由CD80/CD86和CD28作用产生的共刺激。CTLA-4与CD80的相互作用削弱了T细胞参与的免疫应答。申请者的发现包括本专利技术的两个方面。本专利技术的一个方面公布了CD80突变体及其编码核酸。这种CD80突变体拥有CD80的共刺激活性，但不传递CTLA-4与CD80相互作用产生的负信号。这种CD80突变体以蛋白质或其编码核酸的形式与蛋白质免疫原或编码这种蛋白质免疫原的DNA共同给予个体细胞，从而可用于免疫方案。本专利技术的这个方面，CD80突变体是免疫方案中的分子佐剂。本专利技术的另一方面，包括含有C区CD80突变体及其编码核酸。这种CD80突变体可以传递CTLA-4与CD80相互作用产生的负信号。这种CD80突变体用于治疗诸如自身免疫病或细胞、组织、器官的移植物排斥反应。这种产生负信号CD80突变体以蛋白质或其编码核酸的形式给予个体细胞。本专利技术这一方面的CD80突变体是自免疫和免疫抑制治疗物。人CD80的核酸序列及氨基酸序列已公布，源自Freeman等(1989)免疫学杂志(J.Immunol.)，143(8)2714-2722，Selvakumar等(1992)免疫遗传学(Immunogenetics)36(3)175-181，Freeman等(1991)外科学杂志(J.Ex.Med.)174(3)625-631，Lanier等(1989)免疫学杂志154(1)97-105及Genbank接入号P33681，这文献在此收录以做参考。CD86(B7.2)最早出现于Azuma，M.等，自然杂志(Natare)，199336676-79，该文献引入本文作参考。附图2B显示B7.2的核酸序列和可能的氨基酸序列，此序列信息参见Genbank数据库U04343，在此引入以做参考。人CD80表达产生一个288个氨基酸的蛋白质，加工后成为由35-288个氨基酸组成的成熟蛋白质。CD80分为4个区可变(V)区、恒定(C)区、跨膜(tm)区、胞质尾区(ct)。35-242的氨基酸都是胞外区。其中43-123为V区，也称类免疫球蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经分离的蛋白质，至少包括８０Ｖ、８０ｔｍ和８０ｃｔ中的一个，且不含有８０Ｃ；其中所述蛋白包括８０Ｖ或８６Ｖ或这两者，并且选择性地包括由８６Ｃ、８０ｔｍ、８６ｔｍ、８０ｃｔ和８６ｃｔ中的一个或多个，其中： ８０Ｖ是指ＣＤ８０的可变区或其功能片段； ８６Ｖ是指ＣＤ８６的可变区或其功能片段； ８６Ｃ是指ＣＤ８６的Ｃ区或其功能片段； ８０ｔｍ是指ＣＤ８０的跨膜区或其功能片段； ８６ｔｍ是指ＣＤ８６的跨膜区或其功能片段； ８０ｃｔ是指ＣＤ８０的胞质尾区或其功能片段；且 ８６ｃｔ是指ＣＤ８６的胞质尾区或其功能片段。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：戴维B韦纳，迈克尔G阿加贾恩延，拉菲克P塞卡利，马克霍尔特曼，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚大学理事会，蒙特利尔大学，蒙特利尔临床研究学院，
类型：发明
国别省市：US[美国]