用于红细胞代用品的交联血红蛋白的制备方法技术

用于红细胞代用品的交联血红蛋白的制备方法，是使已作脱氧处理后的血红蛋白溶液在ｐＨ６．０－７．５，以及混合有为血红蛋白分子１－１０倍摩尔比的多氨基化合物作为交联竞争抑制剂的条件下，以充分分散的形式加入为血红蛋白分子７－１４倍摩尔比的戊二醛反应，反应完毕再次加入多于封闭全部戊二醛的醛基所需量的竞争抑制剂后，按常规方式进行还原反应并作常规过滤和超滤后，即得到分子量分布合适的交联聚合血红蛋白溶液。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种制备用于红细胞代用品的交联血红蛋白的方法。具体讲是以血红蛋白，特别是以人血红蛋白为基础，为使其在特性上能更适宜用作红细胞代用品而进行的化学交联处理方法。
技术介绍
血红蛋白作为血液中的天然氧气运输成分，是目前制备红细胞代用品的主要目标。现已了解，血红蛋白是一种由四个亚基组成的四聚体形式的结构，其中包括了两个α亚基和两个β亚基，每个亚基有一个球蛋白肽链，四聚体物的分子量约为64,000道尔顿，其中每个亚基的分子量相近。研究发现，四聚体的血红蛋白脱离了红细胞后极易离解为αβ二聚体，在某些情况下，甚至还会进一步离解为α亚基和β亚基的单体。由于离解后的血红蛋白分子量太小，使其不能在身体的循环系统内保留而迅速被肾脏过滤，随尿排出体外。因其半衰期太短，且易引起肾损伤，故达不到作为红细胞代用品的作用。另外，由于未交联聚合的血红蛋白分子能穿过血管壁而与血管舒张因子NO结合，导致血管收缩，使血压升高。因此，使上述血红蛋白亚单位之间和在两个和多个四聚体之间进行交联聚合，使之形成分子量大于64,000道尔顿的血红蛋白寡聚物和多聚物，以延长其半衰期，并消除肾毒性等副作用是非常必要的。文献报导显示，科学家们已为此进行了大量的研究工作，以期制备出一种令人满意的以血红蛋白为基础、并能克服血红蛋白在血红细胞之外在化学性质上的不利因素的红细胞代用品。在使血红蛋白分子进行交联聚合，形成分子量大于64,000道尔顿的血红蛋白寡聚物和多聚物的过程中，这些工作的目的主要是寻找适当的交联剂，以及适当的反应条件。在交联剂的选择中，目前一般多是以开环棉子糖、三糖棉子糖等糖类，或是以戊二醛为交联剂。在采用糖类化合物作为交联剂的方法中，如，4,857,636号的美国专利文献提出了一种以糖类作为交联剂，在20∶1摩尔比的条件下进行反应，对得到稳定的联分子是有益的。第5,770,727号美国专利报导了采用开环棉子糖为交联剂的方法，在pH5.0-7.0的缓冲体系下，以交联剂与血红蛋白摩尔比为1～4∶1反应24小时，得到的交联血红蛋白中四聚体的含量为40％，二聚体含量小于5％。公开号为CN 1105800A的中国专利文献报导了一种以由环开放氧化的双/三糖如棉子糖为交联剂，在pH5.0-7.0的条件下，以摩尔比为1∶1～4∶1的bis-tris缓冲体系中反应，所得的交联产物中无大于600K道尔顿的分子，脱氧血红蛋白含量在1％-15％。由于以糖类化合物为交联剂进行反应时，血红蛋白易发生分子内的交联，因此所得交联产物中的四聚体等不需要的小分子血红蛋白的比例较大，因此，在交联反应中使用较多的另一种交联剂是戊二醛。在采用戊二醛为交联剂的方法中，第5,194,590号和第6,323,320号美国专利采用的反应体系均为pH8.0的偏碱性，底物的血红蛋白的浓度为14-15克/100毫升，以戊二醛为血红蛋白分子摩尔比14.8-18.1倍的方式反应3.5-4小时，可得到70％的聚合物，反应7小时的聚合转化率可达80-90％，但高分子部分的量显著增加；第5,753,616号美国专利报导了以巯基化合物作为稳定剂，底物血红蛋白浓度为40克/升，在pH7.6-7.9的条件下，以交联剂为血红蛋白20-40倍摩尔比和42℃条件下反应5小时；第5,895,810号美国专利报导了一种采用类似方式的制备方法。试验发现，交联反应中生成的超大分子，例如分子量＞600,000道尔顿的交联产物，对于后期的纯化、终产品的粘度、稳定性等均有极为不利的影响。现已有试验结果显示，在采用戊二醛为交联剂的方法中，影响交联反应，尤其是影响其交联反应产物分子量分布的不均匀、以及超大分子量产物形成的因素较多，例如，仅反应环境的pH高低就可以有较大的影响，特别是在偏碱性的反应环境中，由于易使血红蛋白分子中的胺基的活性过高，是形成超大分子产物的重要原因之一。
技术实现思路
针对上述情况，本专利技术提供的是一种以戊二醛为交联剂使血红蛋白进行交联反应，以制备可用作红细胞代用品的交联聚合血红蛋白的更为理想的方法。该方法能在更为简化的反应条件和缩短反应时间的前提下，制备出对高铁血红蛋白的控制较好，交联产物的分子量分布也更为满意的交联聚合血红蛋白。本专利技术，采用的是以戊二醛为交联剂对血红蛋白的水溶液进行处理。具体处理方法，是使已作脱氧处理后的血红蛋白溶液在pH6.0-7.5，以及混合有为血红蛋白分子1-10倍摩尔比的多氨基化合物作为交联竞争抑制剂的条件下，以充分分散的形式加入为血红蛋白分子7-14倍摩尔比的戊二醛反应，反应完毕再次加入多于为封闭残留戊二醛的醛基所需量的竞争抑制剂后，按常规方式进行还原剂反应并作常规过滤和超滤后，即得到分子量分布合适的交联血红蛋白溶液。其中，作为反应底物的血红蛋白溶液的重量/体积浓度一般可以在8％-14％的范围内。在本专利技术的上述方法中，可以作为原料使用的血红蛋白，虽并不排除如上述文献所报导的使用由牛血细胞分离得到的牛血红蛋白，但为避免如疯牛病等人与动物间可能发生的一些交叉感染性疾病，以及避免因异源性蛋白可能带来的免疫问题和随外源性基因而可能引发的更深层次的问题，特别建议的是采用人血红蛋白，其中可以包括由人的外周血和/或胎盘血中分离得到的人血红蛋白。在按本专利技术方法进行交联反应时，所用的血红蛋白溶液，既可以是由人红细胞中直接分离并经纯化的天然人血红蛋白溶液，也可以是按常规方式以5-磷酸吡哆醛对该血红蛋白又进行了PLP修饰所得到的吡哆醛血红蛋白溶液。如上述，戊二醛为交联剂对血红蛋白进行交联反应时，反应环境的pH对交联反应有明显的影响。例如，以血红蛋白溶液的浓度为12％(w/v)和戊二醛与血红蛋白分子的摩尔比为20∶1的同样条件下，使上述的交联反应分别在pH＝7.30和pH＝6.80的不同反应体系中进行的试验结果显示，以高压液相对两者的反应产物进行检测发现，前者产物中分子量＞60万D(道尔顿)的交联血红蛋白的比例可达33.9％，后者的则只有23.9％。因此本专利技术方法将交联反应的条件控制在中性偏酸、弱酸性及中性生理条件的环境，即在pH＝6.0-7.5的范围内进行，而不是碱性的条件，是使交联反应产物中＞60万D部分的交联血红蛋白的比例能得到满意控制的一个重要因素。试验结果还显示，在上述方法的基础上，如能适应随交联反应的进行，反应底物逐渐减少和反应产物逐渐增多的反应进程的变化，进一步将对反应环境条件pH的控制方式采用由低向高逐步调节的形式，即使反应条件中的pH6.0-7.5采用在加入戊二醛之前为pH＝6.0-6.5；加入戊二醛以后，再使反应溶液的pH渐升高至7.0-7.5的形式。这样，可以在使超大分子产物的生成得到有效的控制，并提高交联反应的转化率方面能产生更为理想的效果。例如，采取这种调节pH形式时较为简单的方式之一，是采取分段方式调节pH，即在加入戊二醛之前先将反应溶液调节成pH＝6.0-6.5；自戊二醛的加入后期起，再将pH调至7.0-7.5。这里所说的戊二醛的加入后期，则既可以是在戊二醛的加入后期随戊二醛的加入同时进行pH的调节，也可以是在戊二醛全部加入后，再进行第二次的pH调节。以戊二醛为交联剂进行的上述交联反应如能在无氧环境中进行，对于控制产物中高铁血红蛋白成分的比例是有利的。基于同本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于红细胞代用品的交联血红蛋白的制备方法，以戊二醛为交联剂对血红蛋白溶液进行处理，其特征是使已作脱氧处理后的血红蛋白溶液在ｐＨ６．０－７．５，以及混合有为血红蛋白分子１－１０倍摩尔比的多氨基化合物作为交联竞争抑制剂的条件下，以充分分散的形式加入为血红蛋白分子７－１４倍摩尔比的戊二醛反应，反应完毕再次加入多于为封闭残留戊二醛的醛基所需量的竞争抑制剂后，按常规方式进行还原反应并作常规过滤和超滤后，即得到分子量分布合适的交联血红蛋白溶液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨成民，王红，杨晓明，张鸿辉，王雁峰，刘嘉馨，谢成莲，李强，余璟，
申请(专利权)人：杨成民，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]