含游离半胱氨酸残基的蛋白重折叠的方法技术

本发明专利技术涉及制备具有游离半胱氨酸的重折叠不溶或聚集蛋白的新方法，其中宿主细胞表达的蛋白接触半胱氨酸阻断剂。然后，可修饰该新方法制备的可溶重折叠蛋白以增加它们的效力。这种修饰包括连接ＰＥＧ部分以形成ＰＥＧ化蛋白。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般涉及制备至少含有一个“游离”半胱氨酸残基，即不参与二硫键的半胱氨酸的蛋白，更特别地涉及重组蛋白的方法。
技术介绍
蛋白治疗剂通常应该通过注射给予患者。多数蛋白治疗剂从体内被快速清除，迫使频繁地注射，常常是每日注射。人们对发展延长蛋白治疗剂在体内的循环半衰期使得不必频繁注射蛋白的方法有很大的兴趣。已证明用聚乙二醇(PEG)共价修饰蛋白是延长蛋白在体内循环半衰期的有效方法(Abuchowski等1984；Hershfield，1987；Meyers等1991)。PEG与蛋白共价连接可增加蛋白的有效大小并降低其从体内的排除速率。商业上可得到几种大小的PEGs，允许在使用不同大小PEGs过程中根据个体征象制定PEG修饰蛋白的循环半衰期。其它引证的PEG修饰的体内益处是蛋白溶解度和稳定性增加，和蛋白免疫原性降低(Katre等1987；Katre，1990)。一个已知的PEG化蛋白的方法是使用半胱氨酸反应性PEGs将PEG与半胱氨酸残基共价连接。商业上可获得大量带有不同反应基团(如马来酰亚胺、乙烯砜)高度特异、半胱氨酸反应性PEGs和不同大小PEGs(2-40kDa，单链或支链)。在中性pH下，这些PEG试剂选择性连接“游离”半胱氨酸残基，即不参与二硫键的半胱氨酸残基。大多数蛋白中的半胱氨酸残基参与二硫键，不能使用半胱氨酸反应性PEGs进行PEG化。通过使用重组DNA技术体外诱变，另外的半胱氨酸残基可引入蛋白的任何位置。新添加的“游离”或“非天然”半胱氨酸残基可用作采用半胱氨酸反应性PEG的PEG分子的特异性结合的位点。新添加的“游离”或“非天然”半胱氨酸残基可置换蛋白中现存的氨基酸，添加到成熟蛋白氨基末端之前或成熟蛋白羧基末端之后，或插入到蛋白中两个正常相邻的氨基酸之间。可供选择地，参与天然二硫键的两个半胱氨酸之一可以缺失或被另一个氨基酸置换，留下一个天然半胱氨酸(蛋白中正常将与被缺失或置换的半胱氨酸残基形成二硫键的半胱氨酸残基)游离并可利用进行化学修饰。优选置换半胱氨酸的氨基酸是中性氨基酸如丝氨酸或丙氨酸。例如，人生长激素(hGH)具有两个可用碘乙酰胺还原和烷基化而不影响生物活性的二硫键(Bewley等(1969))。四个半胱氨酸的每一个将是缺失或被另一个氨基酸置换的合理目标。已知几个天然产生蛋白含有一个或多个“游离”半胱氨酸残基。这种天然产生蛋白的实例包括人白介素(IL)-2(Wang等1984)，β干扰素(Mark等1984；1985)，G-CSF(Lu等1989)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Thompson，1992)。IL-2，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和β干扰素(IFN-α)含奇数量半胱氨酸残基，而碱性成纤维细胞生长因子含有偶数量半胱氨酸残基。由于游离巯基在生理条件下的反应性，含游离半胱氨酸残基的重组蛋白的表达已经成为问题。含游离半胱氨酸的几个重组蛋白已经在细胞质表达，即，如细胞内蛋白，在细菌如大肠杆菌中表达。实例包括天然蛋白如IL-2，β-干扰素，G-CSF和IL-2的工程化半胱氨酸突变蛋白(mutein)(Goodson and Katre，1990)，IL-3(Shaw等1992)，肿瘤坏死因子结合蛋白(Tuma等1995)，胰岛素样生长因子-I(IGF-I，Cox andMcDermott，1994)，胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1，Van Den Berg等1997)和蛋白酶连接蛋白和相关蛋白(Braxton，1998)的半胱氨酸突变蛋白。所有这些蛋白在大肠杆菌中细胞内表达时大多不溶解。不溶蛋白很多无活性，为了恢复有效的生物活性需要重折叠(refolding)。在有些情况下，还原剂二硫苏糖醇(DTT)用于辅助溶解和/或不溶蛋白的重折叠。纯化的重折叠的IL-2，G-CSF和β干扰素蛋白不稳定且在生理pH下失去活性，明显是由于涉及游离半胱氨酸残基的二硫键重排(Wang等1984；Mark等1984；1985；Oh-eda等1990；Arakawa等1992)。丝氨酸取代这些蛋白中的游离半胱氨酸残基产生在生理pH下更稳定的蛋白(Wang等1984；Mark等1984；1985；Arakawa等1993)。第二个已知的在细菌中表达重组蛋白方法是将它们分泌到周质间隙(periplasmic space)或培养基中。已知某些重组蛋白如GH当分泌到大肠杆菌周质时，以可溶活性形式表达，而它们在大肠杆菌中细胞内表达时是不溶的。通过将编码GH或其它目的蛋白的DNA序列与编码细菌信号序列如来自stII(Fujimoto等1988)和ompA蛋白(Ghrayeb等1984)的DNA序列融合达到分泌。需要重组蛋白在细菌中分泌，因为可以保留重组蛋白的天然N末端。重组蛋白的细胞内表达需要重组蛋白的氨基末端存在N末端甲硫氨酸。许多成熟形式的人蛋白的氨基末端正常不存在甲硫氨酸。例如，成熟形式人GH的氨基末端氨基酸是苯丙氨酸。为了所述蛋白在细菌中有效表达，氨基末端甲硫氨酸应该添加到重组蛋白的氨基末端，如果这个位置不存在甲硫氨酸的话。典型添加氨基末端甲硫氨酸是通过在编码重组蛋白的DNA序列前添加ATG甲硫氨酸密码子完成的。添加的N末端甲硫氨酸常常不从重组蛋白中去除，特别是如果重组蛋白不溶的话。hGH是这种情况，其中当蛋白在大肠杆菌中细胞内表达时不去除N末端甲硫氨酸。添加的N末端甲硫氨酸产生在人中可潜在刺激免疫反应的“非天然”蛋白。相比之下，使用stII(Chang等1987)或ompA(Cheah等1994)信号序列分泌到周质间隙的hGH没有添加的甲硫氨酸；重组蛋白始于天然的氨基末端氨基酸苯丙氨酸。天然hGH蛋白序列被保留，因为细菌酶在stII(或ompA)信号序列和成熟hGH蛋白的起始点之间切割stII-hGH蛋白(或ompA-hGH蛋白)。hGH具有形成二硫键的四个半胱氨酸。hGH可用stII或ompA信号序列分泌到大肠杆菌周质中。分泌的蛋白可溶且具有生物活性(Hsiung等1986)。主要分泌形式的hGH是十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定表观分子量为22kDa的单体。可使用渗透压休克(osmoticshock)方法从周质间隙分离重组hGH(Koshland and Botstein，1980)，优选将周质而不是细胞内蛋白释放到渗透压休克缓冲液中。然后用柱层析纯化释放的hGH蛋白(Hsiung等1986)。大量GH突变体已经分泌到大肠杆菌周质中。分泌的突变蛋白可溶且可使用类似用于纯化野生型GH的步骤纯化(Cunningham and Wells，1989；Fuh等1992)。出乎意料的是，当用类似的步骤用于分泌含游离半胱氨酸残基的GH变体(五个半胱氨酸；2N+1)时，发现当使用标准渗透压休克分离和发展用于GH的纯化步骤时，某些重组GH变体不溶或形成多聚体或聚集。在渗透压休克裂解产物中，非还原型SDS-PAGE可检测到极少量的单体GH变体蛋白。不溶或聚集的GH变体与可溶的正确折叠的hGH相比，生物活性降低。没有描述含游离半胱氨酸残基的不溶的分泌的生长激素变异体重折叠为生物活性形式的方法。α干扰素(IFN-α2)也含有形成两个二硫键的四个半胱氨酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备重折叠可溶形式的不溶或聚集蛋白的方法，其中所述蛋白是生长激素超基因家族成员且含一个或多个游离半胱氨酸残基，所述方法包括步骤：ａ．使宿主细胞表达蛋白，所述蛋白是不溶或聚集形式的生长激素超基因家族成员；ｂ．用化学方法、酶学或物理方法 裂解细胞；ｃ．使不溶或聚集的蛋白接触变性试剂、还原剂和半胱氨酸阻断剂而溶解不溶或聚集的蛋白；和ｄ．通过使变性试剂和还原剂的浓度降低到足以允许蛋白复性为可溶的生物活性形式的水平而重折叠蛋白。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：玛丽S罗森达尔，乔治N考克斯，丹尼尔H多尔蒂，
申请(专利权)人：博尔德生物技术公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]