疫苗制造技术

本发明专利技术涉及疫苗，其包含蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9(PCSK9)的至少两个片段，其中所述至少两个片段包含PCSK9(SEQ ID No.9)的氨基酸残基150至170和/或205至225的至少8个连续氨基酸残基。

vaccine

The present invention relates to vaccines comprising a proprotein convertase subtilisin /kexin type 9 (PCSK9) at least two segments, wherein the at least two fragments containing PCSK9 (SEQ ID No.9) amino acid residues 150 to 170 and / or 205 to 225 at least 8 consecutive amino acid residues.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】疫苗本专利技术与针对PCSK9的新颖组合免疫原性肽疫苗的开发有关，所述组合免疫原性肽疫苗源自与免疫原性载体联系的两种不同PCSK9表位的组合。所述疫苗建立用于预防和/或治疗由高脂血(hyperlipidemia)，高胆固醇血(hypercholesterolemia)和动脉粥样硬化(atherosclerosis)引起的健康病症。高脂血、高胆固醇血、高血压和动脉粥样硬化是视为全世界致死率的主要因素的心血管病症。与诸如肥胖、糖尿病、吸烟和缺乏物理活动等因素一起，形成心血管变化的主要因素是遗传病症，诸如常染色体显性高胆固醇血(ADH)。认为ADH是形成心血管病症的一项重要因素，并且表现为受损的胆固醇代谢和升高的低密度脂蛋白胆固醇水平，其随后导致形成早发冠状动脉疾病(CAD)。已知三种主要的遗传变化可以引起ADH的形成。经典的ADH形式由低密度脂蛋白受体(下文称作LDLR)中的突变引起。另外，载脂蛋白B-100(apoB-100)中及更具体地在其配体结合域中的突变破坏ApoB-100对LDLR的结合，这随后导致受损的胆固醇代谢。最终，通过遗传变化可以牵涉ADH形成的第三种且新近发现的要素是蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9(下文称作PCSK9)。PCSK9，又称为神经凋亡调节转化酶1(NARC-1)，是一种鉴定为分泌性枯草杆菌酶(subtilase)家族的第9个成员的蛋白酶K样枯草杆菌酶。PCSK9蛋白以约72kDa蛋白原(proprotein)合成，该蛋白原经历前域(prodomain)和催化域之间的自身催化切割，因此导致成熟蛋白质形式的生成。前域(约14kDa)与成熟蛋白质63kDa保持结合，并且在此形式中，成熟的蛋白质向分泌途径行进。PCSK9在脂质稳态(homeostasis)中的作用已经公知。PCSK9的表达不仅以与牵涉脂质稳态的其它SREBP响应性基因相似的方式受到固醇调节元件结合蛋白(下文称作SREBP)调节。而且，PCSK9还牵涉通过促进LDLR内在化和降解实现的低密度脂蛋白胆固醇(下文称作LDLc)清除。体外和体内研究突出显示PCSK9在从血液摄取低密度脂蛋白胆固醇中的本质作用。在一方面，PCSK9腺病毒过表达显著提高循环LDLc的水平，而另一方面，与野生型动物相比，PCSK9-/-小鼠显示LDLR水平的2.8倍升高和LDLc降低。基因位于人染色体1p33-p34.3，并且在组织，诸如肝、肾、小脑和小肠中表达。许多研究确认“功能获得突变(gainoffunctionmutation)”引起LDLR水平降低及随之发生的高胆固醇血和对动脉粥样硬化的素因。“功能失去突变(Lossoffunctionmutation)”提高LDLR的水平，随之发生低密度脂蛋白胆固醇(LDLc)的减少。总之，PCSK9在转录后调节LDLR水平，因此是治疗动脉粥样硬化的一种有吸引力的靶物。同时，已经建立了许多不同策略和办法来抑制PCSK9的功能。在猴(猕猴(Macacafascicularis))中应用针对PCSK9的siRNA导致总体胆固醇的显著减少。在小鼠和非人灵长类中用针对PCSK9的单克隆和多克隆抗体的其它调查继续上调LDLR，伴随总体胆固醇和LDLc水平的降低。通过单克隆或多克隆抗体疗法降低PCSK9水平或小分子抑制剂和敲除技术后PCSK9的失活在不同动物模型中没有显示任何副作用。因此，总而言之，PCSK9是用于治疗动脉粥样硬化的一种非常有吸引力的靶物。WO2011/027257涉及源自PCSK9的免疫原性片段，其可以在用于治疗、预防和减轻PCSK9介导的病症的疫苗中使用。在WO2009/100297中，公开了人PCSK9的拮抗剂。WO2010/057242涉及包含源自人PCSK9的片段的肽的疫苗。本专利技术的目的是提供针对PCSK9的基于肽的疫苗，其能够抑制PCSK9，并且消除/降低PCSK9和LDLR的相互作用。这导致肝的肝细胞中升高的LDLR水平及随后总体胆固醇和LDLc的减少。此目的通过疫苗实现，所述疫苗包含蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9(PCSK9)的多种(超过一种，至少两种)片段，其中所述至少两个片段的第一片段包含PCSK9(SEQIDNo.9)的氨基酸残基150至170的至少8个连续氨基酸残基，且所述至少两个片段的第二片段包含氨基酸残基205至225的至少8个连续氨基酸残基。令人惊讶地，证明了与仅包含一种PCSK9片段的疫苗相比，包含如上文定义的至少两种不同PCSK9肽性片段的疫苗能够有效得多地增加LDL受体量。例如，施用本专利技术的疫苗在肝的肝细胞中在体内导致低密度脂蛋白受体水平升高。作为其结果，施用疫苗后血浆中的LDLc和总体胆固醇的均值数值显著降低。因此，与单一肽的施用相比，施用疫苗本专利技术的疫苗容许以高得多的效率和准确度治疗或预防由高脂血、高胆固醇血和/或动脉粥样硬化引起的疾病。在本专利技术的一个优选的实施方案中，本专利技术疫苗的所有PCSK9片段源自由SEQIDNo.9的氨基酸残基150至170和205至225组成的PCSK9片段。用于本专利技术疫苗的肽性片段包含PCSK9(SEQIDNo.9)的氨基酸残基150至170，优选氨基酸残基153至165，和205至225，优选氨基酸残基209至222的至少8个，优选至少9个，更优选至少10个连续氨基酸残基。SEQIDNo.9(PCSK9氨基酸序列)：源自PCSK9的片段包含优选8至20，更优选10至15个氨基酸残基或者由优选8至20，更优选10至15个氨基酸残基组成。依照本专利技术的一个特别优选的实施方案，源自PCSK9的氨基酸残基150至170的肽包含8至15，优选10至13个氨基酸残基。源自PCSK9的氨基酸残基205至225的肽包含8至16，优选10至14个氨基酸残基。本专利技术的疫苗是源自PCSK9(SEQIDNo.9)的氨基酸残基150至170和205至225的至少2种，优选至少3种，更优选至少4种，甚至更优选至少5种肽的组合。此组合包含至少两种具有不同表位起源的序列。本专利技术的肽可以通过本领域中公知的方法化学合成。当然，也有可能使用重组方法生成本专利技术的肽。肽可以在微生物，诸如细菌、酵母或真菌中，在真核细胞，诸如哺乳动物或昆虫细胞中，或者在重组病毒载体，诸如腺病毒、痘病毒(poxvirus)、疱疹病毒、Simliki森林病毒(Simlikiforestvirus)、杆状病毒、噬菌体、辛德比斯病毒(sindbisvirus)或仙台病毒(Sendaivirus)中生成。适合于生成肽的细菌包括大肠杆菌(E.coli)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或任何其它能够表达此类肽的细菌。适合于表达本专利技术的肽的酵母细胞包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomycespombe)，假丝酵母属(Candida)，巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)或任何其它能够表达肽的酵母。相应的手段和方法是本领域中公知的。用于分离和纯化重组生成的肽的方法也是本领域中公知的，并且包括例如凝胶过滤，亲和层析，离子交换层析，等等。为了便于分离本专利技术的肽，可以生成融合多肽，其中肽与异本文档来自技高网...

【技术保护点】
疫苗，其包含蛋白原转化酶(proprotein convertase)枯草杆菌蛋白酶/kexin型9(PCSK9)的至少两个片段，其中所述至少两个片段的第一片段包含SEQ ID No.9的PCSK9的氨基酸残基153至165的至少9个连续氨基酸残基，且所述至少两个片段的第二片段包含SEQ ID No.9的PCSK9的氨基酸残基209至222的至少9个连续氨基酸残基，所述片段的长度为9至14个氨基酸残基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.09.13 EP 11181090.91.疫苗，其包含蛋白原转化酶(proproteinconvertase)枯草杆菌蛋白酶/kexin型9(PCSK9)的至少两个片段，其中所述至少两个片段的第一片段包含SEQIDNo.9的PCSK9的氨基酸残基153至165的至少9个连续氨基酸残基，且所述至少两个片段的第二片段包含SEQIDNo.9的PCSK9的氨基酸残基209至222的至少9个连续氨基酸残基，所述片段的长度为9至14个氨基酸残基。2.依照权利要求1的疫苗，其中所述至少两个片段选自下组：具有氨基酸序列SIPWNLERITPPR(SEQIDNo.2)，PEEDGTRFHRQASK(SEQIDNo.3)，PEEDGTRFHRQA(SEQIDNo.4)，EEDGTRFHRQASK(SEQIDNo.5)，EEDGTRFHRQAS(SEQIDNo.6)，SIPWNLERITP(SEQIDNo.7)和SIPWNLERIT(SEQIDNo.8)的肽。3.依照权利要求1或2的疫苗，其中PCSK9的至少一个片段具有选自下组的氨基酸序列：SIPWNLERITPPR(SEQIDNo.2)，SIPWNLERITP(SEQIDNo.7)和SIPWNLERIT(SEQIDNo.8)，且PCSK9的至少一个片段具有选自下组的氨基酸序列：PEEDGTRFHRQASK(SEQIDNo.3)，PEEDGTRFHRQA(SEQIDNo.4)，EEDGTRFHRQASK(SEQIDNo.5)和EEDGTRFHRQAS(SEQIDNo.6)。4.依照权利要求1或2的疫苗，其中所述疫苗包含SIPWNLERITPPR(SEQIDNo.2)和PEEDGTRFHRQASK(SEQIDNo.3)，SIPWNLERITPPR(SEQIDNo.2)和PEEDGTRFHRQA(SEQIDNo.4)，SIPWNLERITPPR(SEQIDNo.2)和EEDGTRFHRQASK(SEQIDNo.5)，SIPWNLERITPPR(SEQIDNo.2)和EEDGTRFHRQAS(SEQIDNo.6)，PEEDGTRFHRQAS...

【专利技术属性】
技术研发人员：S布伦纳，G加拉博瓦，B万科，M温沃德尔，G温索尔，C朱诺，G斯塔夫勒，
申请(专利权)人：阿费里斯股份公司，
类型：发明
国别省市：奥地利,AT