对化学合成多肽进行折叠的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于折叠化学合成多肽的方法，包括在一种预先设定了ｐＨ和温度的折叠缓冲液中利用还原剂处理含有两个或多个衍生半胱氨酸残基的多肽和／或蛋白质，其中所述衍生半胱氨酸残基相当于Ｓ－丁基－硫代－半胱氨酸残基而且所述还原剂是半胱氨酸。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种。另外，本专利技术还涉及一种生产生物活性蛋白质的方法。1994年对晶状遍在蛋白质的合成进一步表明高纯度蛋白质可通过基于Fomc/t-Bu方案的SPPS方法来合成，该方法在操作上比Boc/Bzl方法简单而且在化学方面没Boc/Bzl方法复杂，其中所述晶状遍在蛋白质是一种由76个残基组成的小分子蛋白质。到2000年为止，大量的实验证据表明借助肽合成仪通过化学合成可快速、可靠和经济地生产含有60至100个氨基酸残基的单结构域蛋白质，生产量足以进行结构和功能的研究。通过化学合成制备的含二硫键的蛋白质一旦进行了折叠，就具有与天然和基因工程形式的蛋白质相同的特性。蛋白质的二硫键可形成单个或多个链内和/或链间的环状结构，该环状结构给予分子大量的构象限制，因此对稳定生物活性构象起着决定性的作用。结构已知的单结构域折叠蛋白可通过半胱氨酸残基的区域选择性配对来制备。已经对适合于常用保护方案的多种组合形式的半胱氨酸保护基团进行了研究从而使得半胱氨酸残基以分步和成对的方式进行完全选择性的去保护和/或共氧化。然而，最近对一种胰岛素样肽，即人松弛素进行的合成表明在含有多个半胱氨酸残基的蛋白质中进行的半胱氨酸残基的区域选择性配对所涉及的化学过程是多么的复杂。利用SPPS方法、Fmoc/t-Bu方法和对-烷氧基苯甲醇基的树脂来合成A链前体，同时利用PAM树脂(与聚苯乙烯基的树脂连接的4-羧基酰氨基甲基苄基酯)按照Boc/Bzl方法来合成B链前体。将A链前体的四个半胱氨酸残基中的两个半胱氨酸残基以S-Trt(S-三苯基甲基)衍生物的形式保护起来，同时将另外两个半胱氨酸残基分别以S-Acm(S-乙酰氨基甲基)和S-Meb(S-对-甲基苄基)的形式保护起来。B链前体中的两个半胱氨酸被S-Acm和S-Meb保护基团保护起来。首先通过在AcOH中进行碘氧化来形成A链的分子内的S-S键。然后，通过以下两个步骤来形成两个连接A和B链的分子间二硫键在第一个步骤中，通过对A链前体中的S-Meb保护基团进行HF去保护而获得的游离巯基与B链中的被活化的Cys(Npys)(S-3-硝基-2-吡啶亚磺酰基)残基进行反应(目的在于形成分子间的异源二硫键)，以及在第二个步骤中，通过与碘发生共氧化反应来去除S-Acm基团从而获得其余的S-S键。SPPS方法为化学合成制备各种含有用相同保护基团保护的半胱氨酸残基的多肽提供了可能性。一旦利用多种氧化试剂去除了保护基团，就能直接形成二硫键。通过对溶剂、pH和反应时间进行精心调控从而将对氧化反应敏感的Tyr、Met和Trp发生改变的程度降到最低以及避免半胱氨酸的巯基被过氧化成相应的磺酸，在这种条件下利用碘、N-碘代琥珀酰亚胺和碘化氰进行处理，结果含有被S-Trt或S-Acm保护的半胱氨酸的多肽和/或蛋白质都能进行有效的折叠。有时三氟乙酸铊(III)可替代上述氧化剂从而得到较高产率的二硫键。该试剂的主要缺陷在于它的毒性、从靶多肽中去除铊的难度以及需要对Met和Trp残基进行保护以避免被氧化。含有亚砜/甲硅烷基化合物与三氟乙酸的混合物的氧化试剂已被成功地用来将含有S-Acm、S-But、S-Met和S-Mob(S-对-甲氧基苄基)半胱氨酸残基的多肽前体直接氧化形成二硫键。然而，为了避免在氧化条件下的氯化作用需要利用甲酰基对Trp的吲哚环进行保护，这一点严重制约了该混合物的应用。对合成的线性多巯基前体(多肽的还原形式)进行氧化折叠的方法比较普遍而且使用的频率最高。通过该最简单的方法，可在有空气或一些其它温和氧化剂存在的条件下自然形成合适的二硫键。而且，在有被还原形式的(RSH)和被氧化形式的(R-S-S-R)低分子量的巯基化合物同时存在的条件下完成折叠和半胱氨酸的配对。对于由单结构域组成的合成多肽和小分子蛋白质来说，由于H-键合、离子配对和疏水性作用的联合效应而造成折叠所需的热力学推动力显然足以在随机变性氧化反应过程中自然产生天然的异构体。通过对含有多个半胱氨酸的小分子蛋白质如酶、抑制剂、毒素或激素进行氧化折叠研究，获得了有关特定结构基元如被半胱氨酸稳定的β-转角、被半胱氨酸稳定的聚(Pro)-II螺旋折叠和被半胱氨酸稳定的β-β-结构折叠的有用信息，其中所述特定结构基元的稳定作用是形成正确二硫键的主要推动力，即使在较小的肽分子中也如此。如果注意选择对二级结构基元起稳定作用的缓冲液、温度和添加剂，那么即使在体外也能对部分折叠的或不规则的(错折叠的)蛋白质进行完全正确的折叠。为了将分子内半胱氨酸的错误配对减到最少以及尽可能地避免分子间二硫键的随机形成，已经设计了多种适用于多巯基多肽种类的折叠方案，所述分子内半胱氨酸的错误配对导致错折叠的非天然异构体的产生，所述分子间二硫键的随机形成促使发生聚集和沉淀。因此，一般是在中性或弱碱性条件下对高稀释度(1mg/ml或低于1mg/ml)的多巯基形式的前体进行空气氧化。在反应过程中通常需要持续很长时间而且还产生一种无害的副产物，即水。然而，由于痕量金属离子对空气氧化速率影响很大，所以很难对空气氧化进行控制。更重要的是，折叠过程中在或接近它们的碱性或中性等电点时，碱性和疏水性前体分子容易发生聚集作用并从溶液中沉淀出来。而且，由于Met发生氧化而产生的副产物在折叠过程中蓄积。尽管将折叠多巯基前体所需的化学操作步骤减至最少，但是在许多情况下由空气的分子氧促进的二硫键的形成产率非常低，有时根本就不能形成二硫键。DMSO和铁氰化钾也已被用作氧化剂。然而，铁氰化钾必须在暗处使用并且，如果多肽链中含有Met和Trp，那么在折叠过程中积累氧化副产物。由于在酸性条件下能有效进行氧化折叠同时在反应中不生成有害的产物，所以使用DMSO通常能够获得较好的结果。由于进行氧化的碱性和疏水性多肽前体在酸性缓冲液中具有较高的溶解特性，所以该方法特别适用于碱性和疏水性多肽前体的折叠。然而，常常有这样的报道，即从终产物中去除DMSO存在着难度以及对二硫键形成的选择性很低。而且，即使对实验条件进行精心的调控，也总是不能避免形成无规则二硫键，该无规则二硫键导致错折叠的异构体的产生和低聚反应的发生。通过利用氧化还原缓冲液如被氧化的(GSSG)和被还原的(GSH)谷胱甘肽和胱氨酸/半胱氨酸(Cys/Cys)大都能够以较高的产率获得小分子蛋白质的多巯基前体中的半胱氨酸的正确配对和折叠。因此，在由GSSG/GSH或Cys/Cys诱导的核糖核酸酶A(R.R.Hantgan等，生物化学(Biochemistry)13，613，1974)，水蛭素的49个氨基酸核心结构域(B.Chatrenet和J.Y.Chang，生物化学杂志(J.Biol.Chem).267，3038，1992)和牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)(T.E.Creighton，酶学方法(Methods Enzymol).131，83，1986)的氧化折叠过程中，形成游离巯基和二硫基并且在整个折叠过程中不断地进行改构。由于通过硫醇盐中间体进行的巯基/二硫基交换反应可促进非天然二硫键向天然二硫键的改组，所以总的速率和产率通常高于在空气中进行氧化折叠的速率和产率。对于在空气中进行氧化折叠的情况，为了避免聚集和低聚物和聚合物的形成以及最大限度地提高靶蛋白的产本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于折叠化学合成多肽的方法，包括在一种预先设定了ｐＨ和温度的折叠缓冲液中利用还原剂处理含有两个或多个衍生半胱氨酸残基的多肽和／或蛋白质。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：A瓦尔狄尼，G克拉丁，M洛戈罗，
申请(专利权)人：RMF迪克塔吉恩有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]