用于检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的化学发光免疫试剂盒制造技术

本发明专利技术属于医疗检测领域，具体涉及一种用于检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的酶联免疫试剂盒及其制备方法。其包含的试剂有TU M2‑PK磁分离试剂，酶标记的TU M2‑PK抗体溶液，标准品，洗涤液以及化学发光底物溶液。

Chemiluminescence immunoassay kit for detecting tumor type M2 pyruvate kinase

The invention belongs to the field of medical examination, in particular to an enzyme-linked immunosorbent reagent kit for detecting tumor type M2 pyruvate kinase and a preparation method thereof. It contains a TU M2 PK kit magnetic separation reagent, enzyme labeled TU M2 PK antibody solution, standard, washing liquid and chemiluminescence substrate solution.

【技术实现步骤摘要】
用于检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的化学发光免疫试剂盒
本专利技术属于医疗检测领域，具体涉及一种用于检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的化学发光免疫试剂盒及其制备方法。
技术介绍
据报道，恶性肿瘤发病率和死亡率呈逐年上升趋势。降低恶性肿瘤死亡率的主要途径是早期诊断和早期治疗。目前，肿瘤诊断主要依赖影像学检查，细胞学、生化学和免疫学检验。后者为主要检查血清肿瘤标志物(tumormarker，TM)，由于TM的敏感性和特异性相对较高，较为经济，检查时痛苦少，且适合大批量标本检测，TM的临床应用受到了广泛的关注。丙酮酸激酶(PK)是糖酵解途径的一个关键酶，它有四种同工酶，分别为L型、R型、Ml型和M2型，它们的分布具有相对的组织特异性，通常均以酶的活性四聚体形式存在。目前研究表明，几乎所有不同组织来源的肿瘤均伴有丙酮酸激酶的异构重整体M2-PK的过度表达,故称为肿瘤型M2-PK(TumorM2-PK，TUM2-PK)。在正常细胞中，M2-PK主要以三聚体的形式存在，而在肿瘤细胞中，M2-PK大量表达并转变为主要以二聚体的形式存在。三聚体的M2-PK与磷酸烯醇丙酮酸pep亲和力很高，而二聚体的M2-PK与pep的亲和力则低的多，后者因此导致磷酸烯醇类物质的堆积，这有利于肿瘤细胞进行无氧糖酵解。TUM2-PK的升高可见于大多数癌症患者。尽管不同组织来源的肿瘤或同种肿瘤的不同阶段，其血中M2-PK的平均水平存在着一定的差别，但作为肿瘤标志物，M2-PK是很有应用价值的。尤其是肾癌，长期以来一直未发现较特异的肿瘤标志物,M2-PK很可能成为目前唯一可用于临床诊断肾癌的生化指标。早在1993年，在hamburg召开的(德国)第七界肿瘤标志物研讨会上，TUM2-PK就作为一种新的肿瘤标志物被提了出来。因此，监测血液中肿瘤M2型丙酮酸激酶(TUM2-PK)可广泛应用于肿瘤的早期诊断、肿瘤预后判断以及评价肿瘤治疗疗效等方面。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种肿瘤型M2丙酮酸激酶(TUM2-PK)的定量测定试剂盒，其包含的试剂有TUM2-PK磁分离试剂，酶标记的TUM2-PK抗体溶液，标准品，洗涤液以及化学发光底物溶液。.所述TUM2-PK磁分离试剂为含有1mg/ml的偶联有抗TUM2-PK单克隆抗体的磁性微球，0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵，0.1mg/ml的吐温20，0.1mg/ml的PEG200的70mmol/L的PBS缓冲液，pH值为8.0。所述酶标记的TUM2-PK抗体溶液是含有1mg/ml辣根过氧化酶标记的抗TUM2-PK单克隆抗体和1mg/mlBSA的50mmol/L的PBS缓冲液，pH值为8.0。所述的标准品为不同浓度的TUM2-PK标准品溶液，其分别含有0、0.5、1、2、4、8、16、32和64U/ml的TUM2-PK标准品的50mmol/lPBS缓冲液，pH7.4。洗涤液由在浓度为20mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入1％的Tween-20配制而成。所述化学发光底物溶液分为发光底物A溶液和发光底物B溶液；发光底物A为0.1M、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为5.0mg/mL的鲁米诺，所述发光底物B为是pH值为4.5的0.1M柠檬酸缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为100mg/mL的过氧化氢和15mg/mL辣根过氧化氢酶。本专利技术的另一个目的是提供所述试剂盒的制备方法，具体步骤如下：1)TUM2-PK磁分离试剂的制备：采用化学交联法将TUM2-PK单克隆抗体和磁性微球偶联，磁性微球直径在1.0μm左右，制备后用PBS缓冲液冲洗三次，然后用70mmol/L的PBS缓冲液重新悬浮，加入终浓度0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵、0.1mg/ml的吐温20和0.1mg/ml的PEG200，调pH值至8.0即得；2)酶标记的TUM2-PK抗体溶液的制备：采用NaIO4法标记TUM2-PK单克隆抗体，反应后透析纯化，然后用20mmol/L的PBS缓冲液溶解，加入终浓度0.5mg/ml酪蛋白，调pH值至8.0即得；3)常规方法配置标准品、洗涤液和化学底物溶液。在目前的TUM2-PK磁性微球相关免疫检测试剂盒中，稳定性是一个普遍存在的技术问题，导致相关试剂盒即使在4℃下保存期限也仅有九个月左右，而导致试剂盒失效的主要原因是磁分离试剂的稳定性较差，本专利技术通过大量试验摸索得到了一种效果极佳的磁分离试剂的稳定剂组方，从而使试剂盒的稳定性大幅提高。具体实施方式下面将进一步的来举例说明本专利技术。需要指出的是，以下说明仅仅是对本专利技术要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本专利技术的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。实施例1试剂盒制备1)TUM2-PK磁分离试剂的制备：采用0.05mol/L的PBS缓冲液将聚苯乙烯磁性微球悬浮，磁性微球直径在1.0μm左右，磁性微球的质量分数为2.5％；然后向微球溶液中添加终浓度为1mg/ml的TUM2-PK单克隆抗体(所述单克隆抗体与下述酶标记用TUM2-PK单克隆抗体为配对抗体，购自上海研晶生物科技有限公司)，摇匀10分钟，然后向体系中加入2mg/ml碳亚二胺，摇床反应16小时，PBS缓冲液清洗两次，磁性分离，获得偶联有抗TUM2-PK单克隆抗体的磁性微球，然后将偶联有抗TUM2-PK单克隆抗体的磁性微球分散在0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵，0.1mg/ml的吐温20，0.1mg/ml的PEG200的70mmol/L的PBS缓冲液中，调pH值为8.0，从而获得TUM2-PK磁分离试剂。2)酶标记的TUM2-PK抗体溶液的制备：采用常规NaIO4法标记TUM2-PK单克隆抗体，反应后透析纯化，然后用20mmol/L的PBS缓冲液溶解，加入终浓度1mg/mlBSA，调pH值至8.0即得；3)常规方法配置标准品、洗涤液和化学底物溶液。制备后试剂盒组成如下：TUM2-PK磁分离试剂为含有1mg/ml的偶联有抗TUM2-PK单克隆抗体的磁性微球，0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵，0.1mg/ml的吐温20，0.1mg/ml的PEG200的70mmol/L的PBS缓冲液，pH值为8.0。酶标记的TUM2-PK抗体溶液是含有1mg/ml辣根过氧化酶标记的抗TUM2-PK单克隆抗体和1mg/mlBSA的50mmol/L的PBS缓冲液，pH值为8.0。标准品为不同浓度的TUM2-PK标准品溶液，其分别含有0、0.5、1、2、4、8、16、32和64U/ml的TUM2-PK标准品的50mmol/lPBS缓冲液，pH7.4。洗涤液由在浓度为20mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入1％的Tween-20配制而成。所述化学发光底物溶液分为发光底物A溶液和发光底物B溶液；发光底物A为0.1M、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为5.0mg/mL的鲁米诺，所述发光底物B为是pH值为4.5的0.1M柠檬酸缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为100mg/mL的过氧化氢和15mg/mL辣根过氧化氢酶。实施例2试剂盒检测方法a.向微孔板分别加入血清样本和TUM2-PK标准品，每孔20μl；b.依次向每孔加入酶标记的TUM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤型M2丙酮酸激酶(TU M2‑PK)的定量测定试剂盒，其包含的试剂有TU M2‑PK磁分离试剂，酶标记的TU M2‑PK抗体溶液，标准品，洗涤液以及化学发光底物溶液。

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤型M2丙酮酸激酶(TUM2-PK)的定量测定试剂盒，其包含的试剂有TUM2-PK磁分离试剂，酶标记的TUM2-PK抗体溶液，标准品，洗涤液以及化学发光底物溶液。2.根据权利要求1所述的定量测定试剂盒，其特征在于，所述TUM2-PK磁分离试剂为含有1mg/ml的偶联有抗TUM2-PK单克隆抗体的磁性微球，0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵，0.1mg/ml的吐温20，0.1mg/ml的PEG200的70mmol/L的PBS缓冲液，pH值为8.0。3.根据权利要求1所述定量测定试剂盒，其特征在于，所述酶标记的TUM2-PK抗体溶液是含有1mg/ml辣根过氧化酶标记的抗TUM2-PK单克隆抗体和1mg/mlBSA的50mmol/L的PBS缓冲液，pH值为8.0。4.根据权利要求1所述的定量测定试剂盒，其特征在于，所述的标准品为不同浓度的TUM2-PK标准品溶液，其分别含有0、0.5、1、2、4、8、16、32和64U/ml的TUM2-PK标准品的50mmol/lPBS缓冲液，pH7.4。5.根据权利要求1所述的定量测定试剂盒，其特征在于，洗涤液由在浓度为20mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈立国，邹伟权，张亚丽，李庆祥，母润红，王涛，苏焱，
申请(专利权)人：广州华弘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44