基于PP65蛋白检测人巨细胞病毒IgG和IgM抗体的ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及基于PP65蛋白检测HCMV IgG和IgM的试剂盒，包括包被有重组HCMV PP65

ELISA kit for detection of human cytomegalovirus IgG and IgM antibodies based on PP65 protein

The present invention relates to a kit for detection of PP65 protein and HCMV IgG based on IgM, including coated with recombinant HCMV PP65

【技术实现步骤摘要】
基于PP65蛋白检测人巨细胞病毒IgG和IgM抗体的ELISA试剂盒
本专利技术涉及一种检测人巨细胞病毒（HCMV）IgG和IgM抗体的ELISA检测试剂盒。
技术介绍
人巨细胞病毒（humancytomegalovirus，HCMV）可通过口腔、生殖道、胎盘、授乳以及输血或器官移植等多途径传播。人群感染HCMV的显著特点是感染率高，正常成人HCMV抗体阳性率为76.7%－95.8%，我国也是HCMV感染高度流行国家之一。HCMV初次感染可无明显症状，但病毒从此长期潜伏体内。当机体免疫功能低下时，潜伏病毒开始复制并大量增殖，继发活动性感染并表现多种临床症状。HCMV感染是导致出生缺陷的重要因素之一，并且有研究显示HCMV感染与糖尿病、动脉粥样硬化及一些恶性肿的发病密切相关。临床活动性HCMV感染多见于孕妇，新生儿、输血患者、恶性肿瘤和艾滋病患者以及器官移植等使用免疫抑制剂的患者。孕妇活动性感染可通过胎盘、产道或授乳传给胎儿，导致流产，死胎，胎儿形态畸形，器官功能障碍。先天感染的新生儿出生时可伴有黄疸、瘀斑、脉络膜视网膜炎、小头畸形等，而无症状的部分新生儿，随着发育才逐渐被发现听觉、视力低下，智力发育迟缓，运动障碍等。在恶性肿瘤、艾滋病、器官移植等免疫功能减弱或受抑制的患者HCMV的活动性感染常并发间质性肺炎、视网膜炎、食管炎、结肠炎和脑膜脑炎等多器官脏器损害的各种临床综合征，是患者致死或移植术失败的重要原因。无论是初次感染还是潜伏病毒的继发活动性感染，病毒大量复制、出现症状的早期机体会产生IgM型抗体。IgM相对于IgG的特点是产生早、消失快。所以IgM的检出代表近期感染、机体可能尚处于病毒大量复制状态。加之IgM的检测多采用简便快速价格低廉的ELISA方法，所以尽管存在被检出的时间段较短，依然是临床常用的初步判断感染与否的检测方法。而目前检测HCMVIgM的试剂多以HCMV全病毒裂解蛋白作为包被抗原。其抗原成分复杂且潜在宿主细胞蛋白污染的可能，也潜在结合疱疹病毒科其他病毒抗体产生假阳性信号的可能，并且试剂的制作过程因需要培养病毒而操作繁琐。少数HCMVIgM抗体检测试剂虽以HCMV的重组蛋白为包被抗原，试剂制作经济简便，但是试剂的稳定性较差，敏感性和特异性也有待提高。所以研制制作过程简单、费用低廉、敏感性和特异性更好的HCMVIgM抗体检测试剂依然具有实际意义。检测IgG抗体了解人群感染率，对HCMV相关疾病的预防、管理控制及相关政策的制定具有重要意义。而明确个体HCMV已感染状态则利于临床确定个体治疗方案，如AIDS及器官移植术患者，需要检测HCMVIgG抗体，从而确定是否需要跟踪其IgM抗体水平，以便及时抗HCMV治疗。所以HCMVIgG抗体的检测虽然只能代表曾感染、体内潜伏有HCMV，并非病毒活动性感染的指证，但是仍然具有市场需求。目前市售检测HCMVIgG抗体的试剂多以HCMV全病毒裂解物作为包被抗原，其抗原成分复杂且潜在宿主细胞蛋白污染的可能，也潜在结合疱疹病毒科其他病毒抗体产生假阳性信号的可能，并且试剂的制作过程因需要培养病毒而操作繁琐。少数HCMVIgG抗体检测试剂则以HCMV的重组蛋白为包被抗原，这种试剂制作经济简便但是试剂的稳定性较差，敏感性和特异性也有待提高，而进口的此类试剂价格过高。综上所述，需要一种制作过程简单、费用低廉、敏感性和特异性更好的HCMVIgG和HCMVIgM抗体检测试剂。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种基于PP65蛋白检测HCMVIgG和IgM的试剂盒，至少具有特异性、敏感性、稳定性更高的特点。根据本专利技术的一个方面，提供了一种基于PP65蛋白检测HCMVIgG和IgM的试剂盒，包括——包被有重组HCMVPP65322-561蛋白抗原的酶标板；——酶标二抗，包括用于检测IgG的HRP-抗人IgG抗体和用于检测IgM的HRP-抗人IgM抗体。作为优选的技术方案，所述的包被有重组HCMVPP65322-561蛋白抗原的酶标板的制备方法包括步骤：原核表达并纯化HCMV被膜磷蛋白PP65322-561；包被液稀释重组PP65322-561蛋白抗原为10µg/ml，每孔100μl加入酶标板中，37℃1小时，再4℃包被12~24小时；弃去孔内液体，PBST洗后拍干，使用含1%BSA的PBS封闭液每孔100μl，37℃封闭2h，PBST洗后拍干。上述试剂盒可用于检测HCMVIgG抗体和HCMVIgM抗体。作为优选的技术方案，所述的HRP-抗人IgG抗体选自HRP-羊抗人IgG抗体、HRP-兔抗人IgG抗体、HRP-鼠抗人γ链抗体中的一种。所述的HRP-抗人IgM抗体选自HRP-羊抗人IgM抗体、HRP-兔抗人IgM抗体、HRP-鼠抗人µ链抗体中的一种。含HCMV强免疫原性抗原表位的重组蛋白可代替全病毒用于HCMV特异性抗体的检测。HCMVPP65蛋白是HCMV众多结构蛋白中可以特异性激发B细胞、细胞毒性T细胞(CTL)和辅助性T细胞(Th)免疫的主要靶蛋白，不同HCMV病毒株中,HCMVpp65基因高度保守，本专利技术所用PP65332～561片段是富含T细胞表位和B细胞表位的PP65第322到561位氨基酸序列。PP65蛋白是HCMV被膜磷蛋白而非糖基化蛋白，无需真核表达的糖基化和折叠过程，在原核细胞表达就可获得高免疫活性蛋白片段。根据本专利技术的另一方面，提供了一种检测人巨细胞病毒IgG抗体的方法，采用了上述试剂盒。作为优选的技术方案，所述检测人巨细胞病毒IgG抗体的方法包括步骤：稀释的待检血清，于酶标板孔内加样37℃孵育，洗板；加酶标二抗HRP-抗人IgG抗体37℃孵育，洗板；加底物显色液，室温显色；加终止液，酶标仪检测OD450值。根据本专利技术的另一方面，提供了一种检测人巨细胞病毒IgM抗体的方法，采用了上述试剂盒。作为优选的技术方案，所述的检测人巨细胞病毒IgM抗体的方法包括步骤：将IgG-RF吸附剂与待测血清混匀，室温放置；稀释经吸附剂处理过的待测血清，于酶标板孔内加样，37℃孵育后PBST洗板，拍干；加酶标二抗HRP-抗人IgM抗体37℃孵育，洗板；加底物显色液，室温显色；加终止液，酶标仪检测OD450值。待测血清样品中针对包被抗原的特异性IgM常常与特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM的测定。同时，类风湿因子（RF）也会干扰检测结果。因此在血清样品测定前，须加入IgG-RF吸附剂以消除IgG、RF干扰。本专利技术实验探明将IgG-RF吸附剂与待测血清1:1混匀，室温放置30min可去除干扰。本专利技术利用重组PP65332～561蛋白建立了检测HCMVIgG抗体和HCMVIgM抗体的间接ELISA检测方法，证明试剂具有较好的特异性、敏感性、稳定性和可重复性，且试剂制作过程简单、标准易于控制。上述检测方法仅获得中间结果，该结果与疾病的诊断或健康状况无直接必然联系。对于IgG检测方法，阳性仅能说明曾经感染过，主要用于流行病学调查，以利于疾控部门制定政策参考。对于IgM检测方法，如果是阳性，还需要结合其他必要指标才能确定是否处于感染状态，检测群体IgM阳性率也常用于人群近期感染现状的流行病学调查。以广为应用的、业界认为敏感性和特异性均较好的意大利德赛公司检测试本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于PP65蛋白检测人巨细胞病毒IgG和IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于包括：——包被有重组HCMV PP65

【技术特征摘要】
1.一种基于PP65蛋白检测人巨细胞病毒IgG和IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于包括：——包被有重组HCMVPP65322-561蛋白抗原的酶标板；——酶标二抗，包括用于检测IgG的HRP-抗人IgG抗体和用于检测IgM的HRP-抗人IgM抗体。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的包被有重组HCMVPP65322-561蛋白抗原的酶标板的制备方法包括步骤：原核表达并纯化HCMV被膜磷蛋白PP65322-561；包被液稀释重组PP65322-561蛋白抗原为10µg/ml，每孔100μl加入酶标板中，37℃1小时，再4℃包被12~24小时；弃去孔内液体，PBST洗后拍干，使用含1%BSA的PBS封闭液每孔100μl，37℃封闭2h，PBST洗后拍干。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述的HRP-抗人IgG抗体选自HRP-羊抗人IgG抗体、HRP-兔抗人IgG抗体、HRP-鼠抗人γ链抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊卫平，孙俊红，贺美荣，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：山西,14