人工合成多肽有机化合物及其用途制造技术

本发明专利技术提供人工合成多肽有机化合物及其在移植领域中的应用，该多肽有机化合物包括ａ、ｂ二种，能与西非单叶豆凝集素特异性结合，各氨基酸之间通过肽键相连。本发明专利技术的多肽有机化合物，因肽链较短，可由人工化学合成或基因工程的方法大量合成，因其分子量较小、溶于水，容易被机体利用而起效，从而可应用于抑制异种器官移植术中出现的超急性排斥反应的药物的制备。本发明专利技术的多肽有机化合物能与人体内预存的抗猪细胞抗原的天然抗体特异性结合，从而封闭它的作用，可以抑制猪器官移植至人体时发生的超急性排斥反应，而且与人体内预存的天然抗体的结合位点是特异性的，正好起到封闭抗体作用，从而避免了由于作用位点特异性不强而带来的副作用。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属有机化合物，主要涉及人工合成的多肽类有机化合物，尤其是关于人工合成的多肽有机化合物及其在制备药物中的用途。本专利技术提供的多肽有机化合物，包括a、b二种，能与西非单叶豆凝集素(GS-I-B4)特异性结合，溶于水，各氨基酸之间通过肽键相连。本专利技术提供的多肽有机化合物a的氨基酸序列为NCVSPYWCEPLAPSARA，分子量为1864；多肽有机化合物b的氨基酸序列为 (其中第2位的Cys与第8位的Cys之间形成二硫键)，分子量为1862。本专利技术的另一个目的是该人工合成的多肽有机化合物在制备抑制异种器官移植术中出现的超急性排斥反应的药物中的用途。本专利技术的优点有①本专利技术的多肽有机化合物，由于肽链较短，故可以用人工化学合成或基因工程的方法大量合成。以前者为例，可以得到大量较纯的小肽。②本专利技术的多肽有机化合物能与人体内预存的抗猪细胞抗原的天然抗体特异性结合，从而封闭它的作用，可以抑制猪器官移植至人体时发生的超急性排斥反应。③本专利技术的多肽有机化合物与人体内预存的天然抗体的结合位点是特异性的，正好起到封闭抗体作用，从而避免了由于作用位点特异性不强而带来的副作用。④由于本专利技术的多肽有机化合物分子量较小，溶于水，开发成药物后容易被机体利用而起效。图2、为多肽有机化合物抑制西非单叶豆凝集素(GS-I-B4)与猪红细胞的凝集反应结果图。图3、为多肽有机化合物抑制人血清中的天然抗体引起的猪红细胞凝集反应结果图。实施例1用西非单叶豆凝集素(GS-I-B4)作为靶蛋白，用噬菌体展示的方法得到阳性噬菌体克隆噬菌体展示方法利用基因工程手段将合成的一组一定长度的随机序列寡核苷酸片段克隆到特定表达载体中，使其表达产物以融合蛋白的形式呈现在丝状噬菌体表面。由于肽库中包含了该长度小肽的所有可能的氨基酸排列顺序或其中的绝大部分，每一个噬菌体呈现其中的一种肽段，因而库容量极大，易于筛选和扩增。用噬菌体肽库感染大肠杆菌，使重组入噬菌体的随机的寡核苷酸片段在大肠杆菌内复制，并在噬菌体的外壳蛋白中表达出来。然后，把靶蛋白包被在酶标板上。用此噬菌体肽库与靶蛋白混合后，洗板。如果噬菌体上的外壳蛋白能与靶蛋白结合，就不会被洗掉。最后用亲和洗脱液(蜜二糖)把噬菌体洗脱下来。连续这样筛3-4轮，就能筛出与靶蛋白结合力较强的噬菌体。由于GS-I-B4可与Gal-α-1，3-Gal结合，可以得到与Gal-α-1，3-Gal空间结构相似的噬菌展示的小肽。测此噬菌体的DNA序列得到重组寡核苷酸的序列，亦知道了相应小肽的序列。然后可通过人工化学合成或基因工程的方法得到该多肽。本专利技术提供的多肽有机化合物包括a、b两种，能与GS-I-B4特异性结合，溶于水，各氨基酸之间通过肽键相连。本专利技术提供的多肽有机化合物a的氨基酸序列为NCVSPYWCEPLAPSARA，分子量为1864；多肽有机化合物b的氨基酸序列为 (其中第2位的Cys与第8位的Cys之间形成二硫键))，分子量为1862。实施例2蜜二糖竞争性ELISA试验试验方法在4℃用每孔100μl的上述小肽(100μg/ml)包被96孔酶标板两天，用5％BSA室温封闭2小时，用PBS缓冲液洗板3次后，加入1％的人血清50μl和50μl不同浓度的蜜二糖至最终浓度分别为1.0mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/mL，反应1小时，依次用TBST和TBS洗板5次和3次，加入100μl蛋白A-HRP，反应30分钟，依次用TBST和TBS洗板10次和3次，加底物TMB进行显色，加100μl 1M H3PO4终止，用酶标仪测定450nm下的吸光度(OD450)。计算出抑制率＝(未加蜜二糖OD450一加入蜜二糖OD450)/未加蜜二糖OD450×100％。试验结果结果参见附图说明图1，蜜二糖能非常好的抑制人体血清中天然抗体与该小肽的结合，蜜二糖浓度达到0.005mg/ml时，抑制率可达50％，说明该小肽可以竞争性结合在蜜二糖与人血清中的天然抗体结合的位点。以上实例说明了该多肽有机化合物与血清中的人天然抗体的结合位点是特异性的，正好起到封闭抗体作用，从而避免了由于作用位点特异性不强而带来的副作用。实施例3小肽抑制西非单叶豆凝集素(GS-I-B4)与猪红细胞的凝集反应试验方法先把制备好的新鲜3％猪红细胞悬浮在pH7.4的磷酸缓冲液中备用。在V型血凝板的孔里，每孔分别加入40μl浓度为5μg/ml的GS-I-B4和40μl 3％的猪红细胞。然后加入40μl各种不同浓度的小肽，混合液在室温下先震摇1分钟，再静置1小时后观察凝集结果，不同浓度的蜜二糖作为阳性对照。判断凝集标准为如果红细胞沉淀到孔的底部，呈一边缘光滑的圆点，显微镜观察红细胞呈现单个散在状态，则此为没有凝集。如果红细胞形成一网络，并不下沉到孔底，显微镜观测红细胞凝聚成网格状态，此为出现凝集。试验必须设空白、阳性对照。结果参见图2，A1-A2为空白对照，即用40μl猪红细胞和磷酸缓冲液混匀后静置1小时的结果。此结果为未出现凝集(红细胞沉于底部，聚集于一点)。图2中，A3-A4为阳性对照，即用40μl 5.0μg/ml的GS-I-B4和40μl猪红细胞混匀后静置1小时的结果。此结果为出现凝集。(红细胞形成一网络，并不下沉到孔底呈一边缘光滑的圆点)。B，C两条均为蜜二糖抑制猪红细胞凝集的试验结果，即1～4孔分别用磷酸缓冲液稀释蜜二糖，使蜜二糖的浓度分别为1.563mMol/L，0.391mMol/L，0.098mMol/L，0.029mMol/L；然后每孔分别各加入40μl 5.0μg/ml的GS-I-B4和40μl猪红细胞混匀后静置1小时的结果。低达0.098mMol/L浓度的蜜二糖就能够抑制GS-I-B4引起的猪红细胞凝集。D，E两条均为合成小肽抑制GS-I-B4使猪红细胞凝集的试验结果，即1～4孔分别加入小肽浓度为0.214mMol/L、0.054mMol/L、0.014mMol/L、0.004mMol/L，然后加入GS-I-B4和猪红细胞混匀后静置1小时的结果。前二孔能抑制红细胞的凝集，后二孔由于浓度太稀对红细胞的凝集抑制作用不完全。低达0.054mMol/L浓度的合成小肽就能够抑制GS-I-B4引起的猪红细胞凝集。结果说明因为凝集素GS-I-B4可以与猪细胞表面抗原结合引起猪红细胞凝集，而此小肽能与GS-I-B4特异性地结合，从而阻断其与猪细胞表面抗原Gal-α-1，3-Gal结合，使其不能使猪红细胞凝集起来。实施例4小肽抑制人血清与猪红细胞的凝集反应试验方法先把制备好的新鲜3％猪红细胞悬浮在pH7.4的磷酸缓冲液中备用。在V型血凝板的孔里，40μl小肽用磷酸缓冲液依次逐孔倍比稀释后，每孔分别加入40μl的A型人血清(1∶20稀释)和40μl 3％的猪红细胞。然后把此120μl混合液在室温下先震摇1分钟，再静置1小时后观察凝集结果。加入的不同浓度的小肽测试其对人天然抗体介导的猪红细胞凝集抑制作用，本试验中采用蜜二糖作为阳性抑制剂对照。判断凝集标准与实施例3相同，如果红细胞沉淀到孔的底部，呈一边缘光滑的圆点，则此为没有凝集。如果红细胞形成一网络，并不下沉到孔底，此为出现凝集。试验必须设空白、阳性对照。试验结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
人工合成多肽有机化合物及其用途，其特征是：提供的多肽有机化合物包括ａ、ｂ二种，能与西非单叶豆凝集素（ＧＳ－Ｉ－Ｂ４）特异性结合，溶于水，各氨基酸之间通过肽键相连。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：詹金彪，夏铮，许林海，严志焜，王克夷，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]