一种微生物生产氨基羟基苯蚁酸的方法技术

一种微生物生产氨基羟基苯蚁酸的方法，具体是一种青霉生物催化制备医药中间体2‑氨基‑3‑羟基‑苯蚁酸的方法，微生物发酵液中加入底物，进行生物催化反应，产品收率高，反应条件温和，常温、常压操作，解决了现有方法生产条件苛刻的困难。

A method for the microbial production of amino hydroxy benzene formic acid

A method for the microbial production of amino hydroxy benzene carboxylic acid, in particular to a method for Penicillium biocatalytic preparation of pharmaceutical intermediates 2 amino 3 hydroxy benzene carboxylic acid, adding substrate in fermentation liquid, bio catalytic reaction, high yield, mild reaction conditions, ambient temperature and pressure, the method to solve the existing the production of the harsh conditions of the difficulties.

【技术实现步骤摘要】
一种微生物生产氨基羟基苯蚁酸的方法
本专利技术属于制药工程
，特别涉及到青霉生物催化制备医药中间体2-氨基-3-羟基-苯蚁酸的技术。
技术介绍
生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中微生物催化是生物催化最具吸引力的应用领域之一,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。芳烃的羧化反应是一类重要的反应，其产物为芳烃羟基羧酸，是重要的药物合成起始原料。但是，现在的生产采用传统的化学合成，用芳烃与CO2反应，反应压力高达10MPa，温度高达140-380℃，反应选择性差，副产物多。采用微生物催化，则可能改变这种状况。采用微生物催化，可以在常温、常压下反应生产芳烃羟基羧酸，条件温和，选择性高，副反应少，产率高。本专利技术将采用微生物催化反应，生产芳烃羟基羧酸：2-氨基-3-羟基-苯蚁酸。
技术实现思路
本专利技术采用青霉催化制备2-氨基-3-羟基-苯蚁酸，反应式如下：底物2-氨基酚（1）经青霉催化反应，得到产物2-氨基-3-羟基-苯蚁酸（2）。有多种微生物可以催化此反应，经过大量实验筛选，最终确定采用青霉作为催化剂，因为其催化反应的效果最好，副产物极少，反应收率高。许多霉菌都可以进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本专利技术选用青霉菌株为CBS209.28，其催化反应效果最佳。由于底物溶解度较低，所以，加入表面活性剂以增加底物的溶解度。尽管表面活性剂增加了底物溶解度，底物仍然不能很好溶解，属于液-液2相反应，底物、产物的相间传质为反应的限制环节，所以，还需采取措施，以提高反应速度。增加非均相反应的反应界面，是提高非均相反应的有效措施之一。加入表面活性剂后，在强烈搅拌下，反应液成为乳液，使得催化反应界面大幅度增加，从而大幅度提高反应速度。特别是，加入的表面活性剂，必须生物相容，不抑制微生物的催化活性，所以，表面活性剂种类和浓度的选择，是非常重要的。大量实验表明，对于本反应，加入直链的10碳醇聚氧乙烯醚为10-12g/L是最佳的。反应结束后，用有机溶剂萃取产物。需要破乳，有多种方法可以破乳，包括盐析法：加入氯化钠、硫酸铵或氯化钙、氯化镁、硫酸钙、硫酸镁；凝聚法：加入聚合氯化铝、明矾等；或者将上述2类混合加入；加热等。不同产物，所用的方法不同，实验表明，对于本反应，加入1.5%的硫酸钙+0.06%的聚合氯化铝是最佳的。羧化反应中，采用NaHCO3提供CO2,实际上，有多种物质可以提供CO2,但是，通过大量实验，结果表明，对于本专利技术，使用NaHCO3是最佳的。由于加入NaHCO3会使反应液的pH升高，而适宜的pH，对微生物催化反应致关重要，所以，不能一次加入，必须采用流加方式加入NaHCO3。然而，即使流加NaHCO3，反应液的pH仍然升高，所以，还必须采取措施，维持反应液处于适宜的pH，使微生物能够正常发挥生物催化作用。通过大量实验表明，流加盐酸水溶液是适宜的方法，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，可以使溶液的pH处于最佳范围，使生物催化反应正常进行。可以明显看出，本专利技术所涉及的微生物菌株选择、表面活性剂选择、破乳剂选择、CO2供体选择，还有反应温度，反应时间，反应pH，底物浓度，生物催化反应液成分确定等，众多因素均需考虑，并且，它们相互影响。特别是，需要从实验室小试、中试，直到工业规模反应，更是大幅度增加了工作难度、工作量。所以，实验设计至管重要，如此多的因素，生物催化反应动力学理论分析和实验工作量巨大。培养介质：1、种子培养基成份为:酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，麦芽浸膏25-30g，硫酸铵0.5-0.7g/L;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。2、培养液成份：玉米浆(以干物质计)含量为27-31g/L，酵母浸膏9-11g/L，葡萄糖20-24g/L，麦芽浸膏15-18g，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L，碳酸钙0.7g/L,硫酸亚铁0.18g/L,硫酸锰0.025g/L;pH6.4。2、固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉。微生物发酵液制备。青霉CBS209.28经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟冷却至30-31℃，将青霉菌种子液接种至发酵罐，接种比例为8-9％，通气比为1-1.2V/V30-31℃培养42-46小时，发酵液中湿酵母细胞浓度为95-98g/L，此发酵液用作生物催化反应催化剂。用HPLC测产品收率及纯度，C18柱，紫外检测器，波长254nm，流动相为pH3的磷酸缓冲液：甲醇=90:10。生物催化反应：发酵罐,即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物2-氨基酚，使浓度为90-95g/L，补加以下成份，使浓度为：直链的10碳醇聚氧乙烯醚为10-12g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、糯米粉18-22g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至33-35℃时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为49-54小时；反应开始时，立即流加浓度为5％的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1％的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH6.4-6.6，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.6-0.7V/V,即每分钟通气量为0.6-0.7倍反应液体积，反应结束后，破乳，用0.2倍反应液体积乙酸乙酯萃取反应液萃取3次，合并有机相，有机相蒸出乙酸乙酯，得到产物2-氨基-3-羟基-苯蚁酸，反应转化率98.1-99.6％，产品收率95.9-97.1％。具体实施方式实施例1培养液成份：玉米浆(以干物质计)含量为27-31g/L，酵母浸膏9-11g/L，葡萄糖20-24g/L，麦芽浸膏15-18g，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L，碳酸钙0.7g/L,硫酸亚铁0.18g/L,硫酸锰0.025g/L;pH6.4。微生物发酵液制备。青霉CBS209.28经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟冷却至30-31℃，将青霉菌种子液接种至发酵罐，接种比例为8-9％，通气比为1-1.2V/V30-31℃培养42-46小时，发酵液中湿酵母细胞浓度为95-98g/L，此发酵液用作生物催化反应催化剂。生物催化反应：15L发酵罐,即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物2-氨基酚，使浓度为90-95g/L，补加以下成份，使浓度为：直链的10碳醇聚氧乙烯醚为10-12g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、糯米粉18-22g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至33-35℃时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为49-54小时；反应开始时，立即流加浓度为5％的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1％的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH6.4-6.6，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.6-0.7V/V,即每分钟通气量为0.6-0.7倍反应液体积，反应结束后，破乳，用0.2倍反应液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种青霉生物催化制备2‑氨基‑3‑羟基‑苯蚁酸的方法，其特征在于青霉发酵液中加入底物2‑氨基酚，使浓度为90‑95g/L，补加以下成份，使浓度为：直链的10碳醇聚氧乙烯醚为10‑12g/L，木糖20‑24g/L、蔗糖25‑28g/L、糯米粉18‑22 g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至33‑35℃时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为49‑54小时；反应开始时，立即流加浓度为5％的NaHCO

【技术特征摘要】
1.一种青霉生物催化制备2-氨基-3-羟基-苯蚁酸的方法，其特征在于青霉发酵液中加入底物2-氨基酚，使浓度为90-95g/L，补加以下成份，使浓度为：直链的10碳醇聚氧乙烯醚为10-12g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、糯米粉18-22g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至33-35℃时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为49-54小时；反应开始时，立即流加浓度为5％的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1％的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH6.4-6.6，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.6-0.7V/V•分钟,即每分钟通气量为0.6-0.7倍反应液体积，反应结束后，破乳，用乙酸乙酯萃取反应液，有机相蒸出乙酸乙酯，得到产物2-氨基-3-羟基-苯蚁酸，反应转化率98.1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：张媛媛，刘均洪，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东,37