一种新型基因克隆T-载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种新型基因克隆T‑载体及其构建方法和应用。具体为将两侧含XcmI酶切位点的ccdB基因克隆至pBluescript II(KS‑)，分别获得pLS3417和pLS3424，宿主菌为大肠杆菌DB3.1，XcmI酶切去除ccdB基因后获得T‑载体。T‑载体设计为通过保留T和A两个碱基而保持lacZα读码框结构，以提供α‑互补的功能。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物和T‑载体相连后，转化大肠杆菌DH10B，在含氨苄青霉素、异丙基硫代‑β‑D‑半乳糖苷5‑溴‑4氯‑3‑吲哚‑β‑D‑半乳糖苷的筛选平板上，含有自连载体的菌株呈现篮斑，而含重组克隆的菌株为白斑，以此筛选得到重组克隆。

A new type of gene cloning of T vector and its construction method and Application

The invention relates to a novel gene cloning of T vector and its construction method and application. Specific to both sides containing XcmI restriction sites of ccdB gene was cloned into pBluescript II (KS), pLS3417 and pLS3424 respectively, the host bacteria were Escherichia coli DB3.1, XcmI enzyme gene T obtained after removal of ccdB carrier. T carrier designed by T and A retained two bases and keep lacZ a reading frame structure, to provide the function of alpha complementary. The connection between PCR products and T vector Taq DNA polymerase was transformed into Escherichia coli DH10B, containing ampicillin, isopropyl thio beta galactosidase D 5 agar 4 chlorine bromine 3 indole D beta galactoside containing, since even vectors were presented the basket spot, containing the recombinant clone strains were screened by white recombinant clone.

【技术实现步骤摘要】
一种新型基因克隆T-载体及其构建方法和应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体是涉及一种新型基因克隆T-载体及其构建方法和应用。
技术介绍
基因克隆为分子生物学实验的一个常规步骤，是基因功能和蛋白功能研究的基础。克隆PCR产物是基因克隆的主要部分，基因方法有多种，如T-载体法、PCR产物和载体均酶切的方法、USERcloning和ligase-independentcloning等。其中T-载体法由于其简便、快捷和高效等因素而最为常用。T-载体克隆PCR产物以蓝白斑筛选来区分重组克隆和载体的自连。基于大肠杆菌半乳糖苷酶(LacZ)的α-互补蓝白斑筛选的基本原理如下。构建重组克隆的宿主菌如大肠杆菌DH10B和DH5α等基因组上的β-半乳糖苷酶N端31个氨基酸缺失，而克隆载体如pBluescriptKSII(-)等的多克隆位点的一段核苷酸序列可编码如SEQIDNO.9所示的含有相应的31个氨基酸的短肽(LQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEE)。pBluescriptKSII(-)转化至大肠杆菌DH10B后，两者的半乳糖苷酶基因部分互相补充而形成具完整功能的β-半乳糖苷酶。在培养基中含有IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)时，IPTG诱导β-半乳糖苷酶高表达，酶切X-gal得到生色团而形成蓝色菌落。而当外源基因克隆至pBluescriptKSII(-)的多克隆位点后，几乎不可避免地造成读码框的改变而不能表达能互补的31个氨基酸，进而不能获得有功能的β-半乳糖苷酶，X-gal不被酶切，含重组质粒的菌株不变色，呈现白色。挑取白斑来培养、提质粒、酶切和测序即可鉴定出重组克隆。线性化的T-载体在其双链DNA的克隆位点分别含有5'-3'链的T碱基(此即T-载体的名称由来)以及3'-5'链的A碱基。由Taq扩增的PCR产物含有3'-A的突出端，在T4DNA连接酶的作用下，PCR产物和T-载体通过A-T碱基的相互连接而实现PCR产物的克隆。常用的商业化T-载体为美国Promega公司的pGEM-T和pGEMT-easy以及日本Takara公司的pMD19-T和pMD19-TSimple。为保证片段的克隆，这些T-载体的5'-链的T碱基和3'-链的A碱基必需在连接后去除(由T4连接酶中的外切核酸酶活性)才能形成表达完整的31个氨基酸的短肽。以美国Promega公司的pGEM-T为例，其多克隆位点去除其中T和A碱基后，所表达的短肽为MTMITPSYLGDTIEYSSYASNALGALPYGRPAGGRTSDIPRPWRPGACDVGPNSPYSESYYNSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQLRSLNGEWTRPVAAH.(“.”表示终止密码子)(SEQIDNO.10)，可互补宿主菌的β-半乳糖苷酶功能。去除T、A或同时去除T和A则不能获得功能化的短肽，菌株含有所得到的自连载体也表现为白斑，就不能和重组克隆区分开来。这个克隆模式的必需基础是T4连接酶制品中含有外切核酸酶活性，未能实现和PCR产物连接的载体分子在由连接反应中外切核酸酶去除T和A而连接成为环状分子(含有T、A或T和A则不能连接)。
技术实现思路
为克服目前T-载体依赖于T4连接酶制品中含有外切核酸酶活性这一局限性，本专利技术提供了一种通过保留T和A碱基而制备T-载体和克隆PCR产物的方法。具体的实验原理如下。将两侧含XcmI酶切位点的ccdB基因克隆至pBluescriptII(KS-)，分别获得pLS3417和pLS3424，克隆宿主菌为大肠杆菌DB3.1。pLS3417较pLS3424含有更多的酶切位点。XcmI酶切去除ccdB基因后获得T-载体。T-载体设计为通过保留T和A两个碱基而保持lacZα读码框结构，以提供α-互补的功能。以Taq聚合酶扩增的PCR产物和T-载体相连后，转化大肠杆菌克隆宿主菌DH10B，在含氨苄青霉素、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷和5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的筛选平板上，含有自连载体的菌株呈现篮斑，而含重组克隆的菌株为白斑，以此筛选得到重组克隆。以M13R和M13F为测序引物进行克隆片段的测序以验证克隆片段序列的正确性。本专利技术公开了一种新型基因克隆T-载体，它通过下述方法构建得到：将序列如SEQIDNO.13或SEQIDNO.14的两侧含XcmI酶切位点的ccdB基因分别克隆至pBluescriptII(KS-)，分别获得pLS3417或pLS3424，宿主菌为大肠杆菌DB3.1；XcmI酶切去除ccdB基因后获得T-载体。本专利技术还公开了上述T-载体的应用，是以Taq聚合酶扩增的PCR产物和T-载体相连后，转化大肠杆菌DH10B，在含氨苄青霉素、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷和5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的筛选平板上，含有自连载体的菌株呈现篮斑，而含重组克隆的菌株为白斑，以此筛选得到重组克隆。由质粒pLS3417和pLS3424XcmI酶切而获得的T-载体采用不同于商业化T-载体的克隆模式，读码框的选择，即克隆后保留T和A。载体pLS3417保留T和A后所表达的短肽为SEQIDNO.11所示：MTMITPSAQLTLTKGNKSWVPSLNSKDTAGCRDPSSNSPYSESYYARSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQLRSLNGEWKL.；载体pLS3424保留T和A后所表达的短肽为SEQIDNO.12所示：MTMITPSAQLTLTKGNKSWVPSKDTAGSSNSPYSESYYARSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQLRSLNGEWKL.。可见均含功能化的31个短肽序列。质粒pLS3417和pLS3424的不同点在于前者的酶切位点多于后者，提供了更多的将所克隆的DNA片段切出重组克隆的选择；而pLS3424酶切位点较少，其优点是较少酶切位点的干扰。高纯度和高质量中的T4连接酶中的外切核酸酶活性极低。随着未来T4连接酶产品质量的不断提高，外切核酸酶活性可能完全消失。如采用商业化T-载体的克隆模式，则T和A碱基不能去除，由此得到的含重组克隆或自连载体菌株均为蓝斑，这就影响了重组克隆的筛选。而采用本申请所提出的克隆模式就不存在这样的问题，得到的白斑的比例极大。本专利申请的T-载体的另外一个特点是来源质粒(pLS3417和pLS424)中含有作用于DNA拓朴异构酶II的毒性基因ccdB。含ccdB基因的载体中需为宿主菌大肠杆菌DB3.1或其衍生菌株。这些菌株含DNA拓朴异构酶II的A亚单位的DNA螺旋酶GyrAA462C，即第462位精氨酸突变为半胱氨酸的突变，可抵抗CcdB的毒性。常规的克隆宿主菌不含有GyrA的A462C突变，含有ccdB基因的质粒将杀死菌株，而不能做为含ccdB基因的宿主菌。自含ccdB基因的质粒中制备T-载体的设计可避免或大幅避免微量的、未酶切的载体转化宿主菌而造成的转化背景干扰。优选实施例中的两个PCR产物分别高效率地克隆至由pLS3417和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型基因克隆T‑载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将序列如SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14的两侧含XcmI酶切位点的ccdB基因分别克隆至pBluescript II(KS‑)，分别获得pLS3417和pLS3424，宿主菌为大肠杆菌DB3.1；XcmI酶切去除ccdB基因后获得T‑载体。

【技术特征摘要】
1.一种新型基因克隆T-载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将序列如SEQIDNO.13或SEQIDNO.14的两侧含XcmI酶切位点的ccdB基因分别克隆至pBluescriptII(KS-)，分别获得pLS3417和pLS3424，宿主菌为大肠杆菌DB3.1；XcmI酶切去除ccdB基因后获得T-载体。2.一种新型基因克隆T-载体，其特征在于通过下述方法构建得到：将序列如SEQIDNO.13SEQIDNO.13或SEQIDNO.14的两侧含XcmI酶切位点的...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚广东，陈中秋，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32