一种尼罗罗非鱼伪雌鱼的高效诱导及微卫星分子标记鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种尼罗罗非鱼伪雌鱼的高效诱导及微卫星分子标记鉴定方法。本研究通过利用不同剂量雌激素乙烯雌酚(DES)对不同尼罗罗非鱼群体进行了性逆转处理，建立了尼罗罗非鱼伪雌鱼高效诱导方法；进一步应用新开发的性别紧密连锁的微卫星分子标记tlp‑23‑sd及其引物对伪雌鱼进行了鉴定，建立了伪雌鱼微卫星分子标记快速鉴定的方法。本发明专利技术诱导伪雌鱼效率高，鉴定快速准确可靠，可用于尼罗罗非鱼伪雌鱼的生产与鉴定。

Efficient induction of a pseudo female Nile tilapia and microsatellite molecular marker identification method

The invention discloses a highly efficient induction of Nile tilapia pseudo female and microsatellite molecular marker identification method. This study through the use of different doses of estrogen diethylstilbestrol (DES) on different groups of sex reversal of Nile tilapia, established a highly efficient induction method of Nile tilapia pseudo female; the further application of the new development of the gender close microsatellite markers linked to 23 TLP SD and primers for the identification of pseudo female, established the method of false the rapid identification of microsatellite molecular markers. The present invention induced pseudo female high efficiency, rapid identification of accurate and reliable, and can be used for the production and identification of pseudo female Nile tilapia.

【技术实现步骤摘要】
一种尼罗罗非鱼伪雌鱼的高效诱导及微卫星分子标记鉴定方法
本专利技术属于水产遗传育种领域，具体涉及一种尼罗罗非鱼伪雌鱼的高效诱导及微卫星分子标记鉴定方法。
技术介绍
罗非鱼的雌鱼与雄鱼生长存在明显的差异。为了避免过度繁殖，同时利用雄鱼的生长优势，最为实际有效的解决措施是对罗非鱼进行性别控制生产雄性鱼苗，养殖全雄鱼。在罗非鱼当中存在两套不同的主要性别决定系统，尼罗罗非鱼及莫桑比克罗非鱼等性别主要由LG1和23号连锁群上[6,7]上的XX/XY系统决定，而其他一些如蓝罗非鱼性别主要由LG3上的ZW/ZZ系统决定[2,3]。除了性染色体，常染色体上的小因子也能够影响主要的性别决定系统。然而除此之外，罗非鱼的性别还受到环境中的温度和环境激素的影响。在卵孵化10日后开始的高温处理将导致群体中的雄性比率增高[8]。有研究认为温度对于罗非鱼性别发育的影响可能与表观遗传学上的变化相关，Cyp19a，Foxl2，amh，Sox9a，Sox9b等基因在性别分化和决定中起关键作用[8,9]。雌性激素的使用会导致罗非鱼的雌性化，XY个体性逆转，生理性别表现为雌性，此过程可能与调控cyp19a1b，foxl2，amh，DMRT1等基因的表达相关[11,12]。为了得到全雄鱼，在生产过程当中，通常使用雄激素处理使雌鱼发育成雄鱼。罗非鱼受精后0-18天是性别分化至关重要的时期。在此时期，胚胎对激素非常敏感[15]。采用口服雄性激素如甲基睾丸酮处理罗非鱼鱼苗，诱导遗传上的雌鱼转换为功能上的雄鱼是雄性罗非鱼生产的主要方式之一。但是近年来研究发现，甲基睾丸酮的后期消解较为缓慢，随着甲基睾丸酮浓度增大，在罗非鱼鱼苗体内残留的时间延长。若无法确保激素在鱼体内全部代谢完，则可能对人体造成危害，存在食品安全问题[17]。与此同时，激素的使用也造成一些环境问题，影响水产品的安全性，造成阴阳鱼和不育雌鱼的产生及形态异常，内分泌紊乱，激素水平改变等负面影响。生产无公害罗非鱼水产品，保障罗非鱼养殖业可持续健康发展的首要条件就是解决罗非鱼养殖的质量控制问题。使用环保安全的方法，生产绿色无公害的水产品有利于我国罗非鱼养殖的良性发展。培育超雄罗非鱼是解决罗非鱼全雄苗种生产问题的重要途径之一。实验证实尼罗罗非鱼的伪雌鱼(即遗传雄性生理表型为雌性的个体)是可存活的，并且与正常的XX雌性一样是可育的，可以用于全雄鱼的生产。其中，高效诱导伪雌鱼及其快速准确鉴定技术是全雄罗非鱼生产的技术基础。然而，由于鱼类的性染色体构成处于原始状态，所以在形态上难以区分Y和Z，X染色体。由于缺乏准确判断罗非鱼遗传性别的手段，使用传统的选择育种获取全雄鱼存在育种周期长，费时费力的问题。高效诱导伪雌鱼及其鉴定技术是需要解决的核心问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种尼罗罗非鱼伪雌鱼的高效诱导方法，该方法能够将群体中遗传雄性个体进行性逆转，显著增加群体中表型雌鱼的比例；本专利技术还提供一种尼罗罗非鱼伪雌鱼微卫星分子标记鉴定方法，在将群体中遗传雄性个体进行性逆转为表型雌鱼后，利用新开发的标记及其引物对群体基因型数据进行分析能够快速准确鉴定表型雌鱼群体中的伪雌鱼。一种尼罗罗非鱼伪雌鱼的高效诱导方法，其特征在于，在尼罗罗非鱼孵化后开始进食时开始投喂含乙烯雌酚(DES)的开口饲料，连续投喂3周以上，然后再进行常规喂养。优选，所述的含乙烯雌酚的开口饲料，其每1kg所述的含乙烯雌酚的开口饲料中含0.5g-1g乙烯雌酚。进一步优选，所述的含乙烯雌酚的开口饲料，其每1kg所述的含乙烯雌酚的开口饲料中含1g乙烯雌酚。所述的含乙烯雌酚的开口饲料的制备方法，将乙烯雌酚溶于足量无水乙醇后与小鱼开口饲料充分搅拌混合，待小鱼开口饲料充分吸收乙烯雌酚后，充分挥发无水乙醇，干燥，得到含乙烯雌酚的开口饲料。乙烯雌酚在诱导罗非鱼遗传雄鱼性逆转为伪雌鱼中的应用。优选，所述的罗非鱼为尼罗罗非鱼。一种尼罗罗非鱼伪雌鱼的微卫星分子标记引物，其特征在于，所述的微卫星分子标记引物的正向引物的序列如SEQIDNO.1所示，反向引物的序列如SEQIDNO.2所示。一种尼罗罗非鱼伪雌鱼微卫星分子标记鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待鉴定尼罗罗非鱼的基因组DNA，以该基因组DNA作为模板，利用上述尼罗罗非鱼伪雌鱼的微卫星分子标记引物的正向引物和反向引物进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳然后分型，判断是否为伪雌鱼。优选，所述的PCR扩增的反应体系为：2×PCRMastermix10μL，10μM正、反向引物各0.8μL，模板DNA25ng，补充ddH2O至总体积20μL；反应条件为：94℃预变性3min；变性94℃30sec、退火61.5℃30sec、延伸72℃15sec，循环数为34；72℃延伸10min。本专利技术首先通过构建尼罗罗非鱼家系，并利用含雌激素乙烯雌酚(DES)的开口饲料对家系部分个体(处理组)进行性逆转处理，促使其中的遗传雄性个体发育成生理雌性的伪雌鱼。对照组则投喂未添加雌激素的饲料。通过与对照组表型数据进行比较发现，该方法成功的提高了处理组群体的表型雌性个体的比例(95％-100％；表1)。研究确定了罗非鱼最佳DES性逆转处理剂量(1gDES/kg饲料)及饲料配制方法。进一步基于已有研究所定位出的不同染色体(LG1,LG23)性别决定QTL区域，设计微卫星引物，通过群体QTL连锁作图，分析标记与表型关系，最终筛选出尼罗罗非鱼育种家系中与性别性状连锁的LG23上的QTL区间及微卫星标记；进一步应用新开发的与性别紧密连锁的微卫星分子标记tlp-23-sd的引物对激素处理后的群体进行分析，筛选鉴定发生性逆转的伪雌鱼39尾，为生产全雄鱼奠定基础。尼罗罗非鱼微卫星分子标记tlp-23-sd的引物序列如SEQIDNO.1(正向引物)和SEQIDNO.2(反向引物)所示。实现本专利技术的技术如下：一.尼罗罗非鱼伪雌鱼雌激素高效诱导挑选优质尼罗罗非鱼亲鱼构建全同胞家系。将家系分组进行养殖管理(表1)，并利用雌激素乙烯雌酚(DES,0.5g或1gDES/kg开口饲料)对该家系2个处理组分别进行性逆转处理。其中处理组在孵化后开始进食时即投喂添加雌激素DES的开口饲料，每日三次，连续投喂3周，促使其中的遗传雄性个体发育成表型雌性的伪雌鱼。实验设置对照组1组投喂未添加雌激素DES的开口饲料。通过比较对照组(30％)和处理组(95％-100％)的雌性个体比例，证实雌激素(DES)能成功提高家系表型雌性个体的比例(表1)。研究确定投喂含1gDES/kg开口饲料能高效诱导遗传雄性罗非鱼性逆转为生理雌性的伪雌鱼。二.尼罗罗非鱼个体动物电子标签标记及伪雌鱼微卫星分子标记鉴定待鱼生长至性腺发育成熟(约5个月)后，通过人工分辨其外生殖器进行表型性别鉴定，并记录性别和体重，剪取亲本和子一代(对照组96尾雌性个体及96尾雄性个体以及DES处理1组中96尾雌性个体)的鳍条样品保存于无水乙醇中，放入-70℃保存备用。同时，在每条鱼背部注射动物电子标签，记录个体身份信息，用于进一步追踪个体的生长及发育情况。利用基因组DNA提取试剂盒提取所有取样个体基因组DNA。基于已有研究所定位出的不同染色体(LG1,LG23)性别决定QTL区域基因组序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种尼罗罗非鱼伪雌鱼的高效诱导方法，其特征在于，在尼罗罗非鱼孵化后开始进食时开始投喂含乙烯雌酚的开口饲料，连续投喂3周以上，然后再进行常规喂养。

【技术特征摘要】
1.一种尼罗罗非鱼伪雌鱼的高效诱导方法，其特征在于，在尼罗罗非鱼孵化后开始进食时开始投喂含乙烯雌酚的开口饲料，连续投喂3周以上，然后再进行常规喂养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每1kg所述的含乙烯雌酚的开口饲料中含0.5g-1g乙烯雌酚。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，每1kg所述的含乙烯雌酚的开口饲料中含1g乙烯雌酚。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含乙烯雌酚的开口饲料的制备方法为：将乙烯雌酚溶于足量无水乙醇后与小鱼开口饲料充分搅拌混合，待小鱼开口饲料充分吸收乙烯雌酚后，充分挥发无水乙醇，干燥，得到含乙烯雌酚的开口饲料。5.乙烯雌酚在诱导罗非鱼遗传雄鱼性逆转为伪雌鱼中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的罗非鱼为尼罗罗非鱼。7.一种尼罗罗非鱼伪雌鱼的微卫星分子标记引...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏军红，梁明，李碧君，龙金华，谷小慧，李红莲，陈朝豪，
申请(专利权)人：中山大学，广州市五龙岗水产发展有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44