磁性纳米粒子和产生自由基的酶的介孔催化剂及其使用方法技术

一种包括磁性纳米粒子的介孔聚集物和产生自由基的酶(即，结合酶的介孔聚集物)的组合物，其中所述磁性纳米粒子的介孔聚集物具有介孔，在所述介孔中嵌入所述产生自由基的酶。本申请还描述了用于合成结合酶的介孔聚集物的方法。本申请还描述了使用所述结合酶的介孔聚集物将木质素解聚、从水中消除芳香族污染物、以及通过自由基反应使可聚合的单体聚合的工艺。

Mesoporous catalyst for producing magnetic nanoparticles and enzymes for producing free radicals and methods of using the same

A mesoporous magnetic nanoparticle aggregates and free radical producing enzymes (i.e., combination of mesoporous enzyme aggregates) composition, wherein the mesoporous magnetic nanoparticles aggregates with mesoporous, the mesoporous embedded in the free radical producing enzyme. The present invention also describes methods for synthesizing mesoporous aggregates of binding enzymes. The present application also describes processes for the depolymerization of lignin, the removal of aromatic contaminants from water, and the polymerization of polymerizable monomers by free radical reactions using mesoporous aggregates of said binding enzymes.

【技术实现步骤摘要】
磁性纳米粒子和产生自由基的酶的介孔催化剂及其使用方法交叉引用相关专利申请本申请是申请号为201280022702.9、申请日为2012年3月9日、专利技术名称为“磁性纳米粒子和产生自由基的酶的介孔催化剂及其使用方法”的中国申请的分案申请，原申请要求2011年12月9日提交的美国临时申请号61/568,966，和2011年3月10日提交的美国临时申请号61/451,360的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。关于联邦政府资助研究的声明本专利技术在康奈尔大学东北赠日计划(NortheastSunGrantInitiative)的合同中规定的政府资助下进行的，该合同号为美国运输部资助#DTOS59-07-G-00052。政府享有本专利技术的某些权利。专利技术背景过氧化物酶(EC1.11.1)广泛存在于生物系统中，并形成氧化还原酶亚类，所述氧化还原酶亚类将过氧化氢(H2O2)还原成水，从而氧化多种类型的芳香化合物，范围从酚到芳香胺。过氧化物酶反应循环十分复杂，其始于H2O2对亚铁血红素的活化以形成双电子活化的化合物I(N.C.Veitch，Phytochemistry，2004，65，249)。然后化合物I的一个电子被有机底物的氧化反应所还原导致形成化合物II，该化合物的一个电子处于静息状态。第二个还原将酶恢复至静息状态以开始一个新循环。总的来说，对于所消耗的每个过氧化氢分子而言，产生两个芳香自由基并且其能够易于在次级反应中反应。过氧化物酶对主要由H2O2引起的底物抑制高度敏感，其能够导致可逆的酶灭活形式(化合物III)的形成。其活性还被产物的抑制所阻止。因此，与过氧化物酶活性相关的复合动力学能够限制其在多种工艺和生物过程中的应用。增加这一酶家族的活性及其对不同工艺条件的耐受性能够改进其目前的用途，以及为其在新应用中的用途创造条件。专利技术概述本申请发现了由产生自由基(FRP)的酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)，和自组装磁性纳米粒子(MNP)组成的生物纳米催化剂(BNC)增强了酶活性。特别地，本申请令人惊讶地发现，与游离酶和不含酶的磁性纳米粒子簇相比，FRP酶和磁性纳米粒子的自组装簇一般具有更加迅速的翻转和对酶更低的抑制。而且本申请还发现MNP的粒径和磁化强度影响BNC的形成和最终结构，其均对所包封酶的活性具有显著影响。特别地凭借在不同反应条件下令人惊讶的适应性，本申请所述的BNC能够在其它此类试剂目前可以使用的地方用作改进的FRP剂，而且其能够用于FRP酶尚未被考虑或发现适用的其它应用。本申请所描述的方法非常不同于依赖通过复合生化方法将蛋白偶联于表面修饰粒子的经典方法，经典方法通常情况下是以消耗酶活性和反应效率为代价的。通过本方法，仅当酶与MNP紧密结合时HRP的动力学被根本改良，例如初级MNP微晶和过氧化物酶的自组装簇(聚集)。在生物相关底物浓度下，所得的BNC的总活性能够有利地高于游离酶或MNP若干数量级。在一个方面，本专利技术涉及一种组合物，在所述组合物中FRP酶被包埋(即，包封)在磁性纳米粒子或其簇中。在特定实施方式中，所述组合物是由磁性纳米粒子和一种FRP酶或FRP酶组合组装成的介孔簇。所述介孔簇的簇状组装件具有包埋了FRP酶的介孔。在其它实施方式中，前述簇组合物包括表面涂覆了金的磁性纳米粒子。在又一个实施方式中，前述簇组合物进一步包括微米或亚微米粒径的磁性微粒，上有包埋了FRP的磁性纳米粒子。在其它方面，本专利技术涉及一种工艺，上文所述的包埋了FRP的磁性纳米粒子的组合物可用于所述工艺中。在特定实施方式中，所述包埋了FRP的磁性纳米粒子组合物参与了用于解聚木质素的工艺、用于从水中除去芳香族污染物的工艺和用于通过自由基反应使单体聚合生产聚合物的工艺。在另一个方面，本专利技术涉及用于生产上文所述的包埋了FRP的磁性纳米粒子组合物的工艺。在某些实施方式中，首先制备磁性纳米粒子或其聚合物，随后将FRP酶吸附于其中或与其连接。在其它实施方式中，在存在FRP酶的条件下，通过进行磁性纳米粒子的合成生产包埋了FRP的磁性纳米粒子组合物，从而通过自组装机制在MNP簇中包埋所述FRP酶。附图说明图1：在25℃和90℃下合成的磁性纳米粒子的X-射线衍射图。合成的纳米粒子显示了磁铁特征性的X-射线衍射图。在25℃(较小粒径)和90℃(较大粒径)下形成的纳米粒子之间的微晶衍射峰强度存在差异。图2A，2B：在25℃和90℃下合成的磁性纳米粒子的粒径分布图。在25℃和90℃下合成的纳米粒子具有不同的粒径分布。M25纳米粒子(图2A)的平均粒径为8nm，而M90纳米粒子(图2B)的平均粒径为约10nm。图3：在25℃和90℃下合成的磁性纳米粒子的磁化强度图。在25℃和90℃下合成的纳米粒子具有的饱和磁化强度(Ms)分别为约20和50emug-1。其均具有可以忽略不计的剩余磁化强度(Mr)，这使其具有超顺磁性。超顺磁性的性质使其超声后在溶液中形成充分的单分散磁性纳米粒子。图4A-4C：M25和M25-BNC的粒径分布图(图4A)以及M25(图4B)和M25-BNC(图4C)的显微照片。当将酶(HRP)加入初始的单分散磁性纳米粒子后，M25纳米粒子聚集物的粒径增加。酶的存在增加了所述簇的总直径。图5A-5G：M90纳米粒子簇的显微照片(图5A)和相应的粒径图(图5B、5C)，M90-BNC纳米粒子簇的显微照片(图5D)和相应的粒径图(图5E、5F)，以及对M90和M90-BNC簇进行比较的粒径分布图(图5G)。图6：在溶液中单位酶量的情况下，单位有效MNP表面积捕获的酶量的等温线图。测定M90和M25簇中捕获的酶量(利用MNP的表面积进行标准化)。对于在溶液中的初始酶量而言，M90MNP形成的聚集物与M25MNP形成的聚集物相比含有更多的酶。溶液中的酶低于10nmol.m-2，100％的酶被包封在M90形成的簇中，而约有50％包封在M25簇中。图7：M25磁性纳米粒子和M25-BNC酶簇的孔径分布图。M25-BNC是具有直径低于50nm的孔的介孔。较小的磁性纳米粒子形成具有较小孔径的聚集物。孔径分布受酶存在情况的影响，所述的总孔体积低于M25MNP簇的总孔体积，这表明酶占据了介孔的空间。图8：M90磁性纳米粒子和M90-BNC酶簇的孔径分布图。M90NMP聚集形成的簇是介孔的，其具有孔的直径低于50nm。较大的纳米粒子形成具有较大孔径的较大聚集物。孔径分布受酶存在情况的影响，所述的总孔体积低于M90MNP簇的总孔体积，这表明酶占据了介孔的空间。图9A，9B：在4μg/mL和8μg/mL浓度下，针对M25-BNC(图9A)和M90-BNC(图9B)，将活性(酚AAP检测，以U.mmole-1计)作为孵育时间的函数的图，以确定孵育时间对BNC活性的影响。图10：归一化的活性作为检测中使用的磁性纳米粒子(HRP-BNC)浓度(以μg/mL计)的函数的图，用于确定孵育时间对HRP-BNC活性的影响。P5方案：来自稀释的HRP+纳米粒子(M90)1∶1溶液(体积/体积)的3％(体积/体积)预混物；P1方案：来自高浓度的HRP和M90储备溶液的3％(体积/体积)预混物；P3方案：HRP+纳米粒子1∶1(体积/体积)混悬物的14％(体积/体积)预混物；P4方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，所述组合物包括固定在磁性纳米粒子的介孔聚集物上的乳酸过氧化物酶，其中所述磁性纳米粒子的介孔聚集物具有介孔，在所述介孔中嵌入所述乳酸过氧化物酶，其中所述介孔位于所述磁性纳米粒子聚集物的磁性纳米粒子之间，并且其中在所述介孔聚集物中的介孔和磁性纳米粒子聚集物由自组装工艺同时产生，在所述自组装工艺中所述乳酸过氧化物酶和磁性纳米粒子在溶液中结合。

【技术特征摘要】
2011.03.10 US 61/451,360;2011.12.09 US 61/568,9661.一种组合物，所述组合物包括固定在磁性纳米粒子的介孔聚集物上的乳酸过氧化物酶，其中所述磁性纳米粒子的介孔聚集物具有介孔，在所述介孔中嵌入所述乳酸过氧化物酶，其中所述介孔位于所述磁性纳米粒子聚集物的磁性纳米粒子之间，并且其中在所述介孔聚集物中的介孔和磁性纳米粒子聚集物由自组装工艺同时产生，在所述自组装工艺中所述乳酸过氧化物酶和磁性纳米粒子在溶液中结合。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述磁性纳米粒子的介孔聚集物具有氧化铁组分。3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述磁性纳米粒子的介孔聚集物具有的磁性纳米粒子的粒径分布为其中至少90％的磁性纳米粒子具有至少3nm和至多30nm的粒径，以及聚集粒子的粒径分布为其中至少90％的所述磁性纳米粒子的介孔聚集物具有至少10nm和至多500nm的粒径。4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述磁性纳米粒子的介孔聚集物具有至少10emu/g的饱和磁化强度。5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述磁性纳米粒子的介孔聚集物具有至多5emu/g的剩余磁化强度。6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述乳酸过氧化物酶以至多100％的饱和容量包含在所述磁性纳米粒子的介孔聚集物中。7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述介孔的特征为孔径分布为其中具有孔径至少2nm和至多20nm的孔形成了至少90％的孔体积。8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述介孔的特征为孔径分布为其中具有孔径至少2nm和至多20nm的孔形成了至少95％的孔体积。9.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括过氧化物酶。10.根据权利要求9所述的组合...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·C·柯吉亚，P·卡哈旺，E·贾内利斯，L·P·沃克，
申请(专利权)人：康奈尔大学，
类型：发明
国别省市：美国,US