用于叶酸代谢基因分型的核酸杂交膜条、PCR引物及试剂盒制造技术

技术编号:15446816 阅读:68 留言:0更新日期:2017-05-29 18:44
本发明专利技术公开了一种用于叶酸代谢基因分型的核酸杂交膜条、PCR引物及试剂盒,其核酸杂交膜条包括基底,以及在所述基底上固定有特异性的多态检测探针,每一条所述多态检测探针分别对应一个叶酸代谢相关基因多态位点,所述相关基因多态位点包括以下位点中的至少一个:亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因c.677位点、c.1298位点;甲硫氨酸合成还原酶(MTRR)基因c.56位点、c.66位点;甲硫氨酸合成酶(MTR)基因‑186位点、c.2756位点、+905位点;胱硫醚‑β‑合成酶(CBS)基因‑551位点;每一条所述多态检测探针包含13‑25个碱基的序列。本发明专利技术对多态杂合子、多态纯合子等很容易判断,具有高通量、高效率、价格低廉、使用方便等优点。

Nucleic acid hybridization film strip, PCR primer and reagent kit for gene typing of folic acid metabolism

The invention discloses a method for nucleic acid hybridization membrane folate metabolism genotyping, PCR primer and kit, the nucleic acid hybridization membrane comprises a substrate, and a specific fixed on the substrate of the polymorphism detection probe, each of the polymorphism detection probe corresponding to a polymorphism in folate related genes the polymorphic loci, associated gene loci including the following sites in at least one: methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene c.677 locus, c.1298 locus; methionine synthase reductase (MTRR) gene c.56 locus, c.66 locus; methionine synthase (MTR) gene 186 sites, c.2756 sites and +905 sites; cystathionine beta synthase (CBS) gene 551 loci; each of the sequence polymorphism detection probe contains 13 25 bases. The invention has the advantages of high polymorphism, high efficiency, low price, convenient use, etc., and is easy to judge for polymorphism, polymorphism, homozygote, etc..

【技术实现步骤摘要】
用于叶酸代谢基因分型的核酸杂交膜条、PCR引物及试剂盒
本专利技术涉及分子生物学检测,特别涉及一种用于评估叶酸代谢能力的核酸杂交膜条和一种用于扩增待检样品基因片段的聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)引物;本专利技术还涉及一种用于评估叶酸代谢能力的试剂盒。
技术介绍
叶酸代谢与许多重要的生化过程密切相关,一方面它可以影响核酸的合成,另一方面它参与了DNA、蛋白质的甲基化,此外还直接影响氨基酸的代谢,对细胞分裂、增殖和组织生长具有极其重要的作用。研究表明,叶酸代谢紊乱可影响DNA和氨基酸的合成及甲基化过程,并可导致高同型半胱氨酸血症,与先天性心脏病、神经管畸形等出生缺陷以及反复流产等有密切关系。叶酸代谢紊乱的因素十分复杂,包括饮食中叶酸及甲基供体等缺乏,叶酸代谢相关酶的遗传多态性,酒精和吸烟的影响等等。参与到叶酸代谢途径的酶有多种,包括二甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、甲硫氨酸还原酶(MTR)、甲硫氨酸合成还原酶(MTRR)和胱硫脒β合酶(CBS)等,这些酶的某些核苷酸多态可导致叶酸代谢异常引起疾病或出生缺陷,其中母亲高同型半胱氨酸水平是先天性心脏病的高危因素。MTHFR是叶酸代谢的关键酶,催化5,10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸,后者与同型半胱氨酸共同被催化形成蛋氨酸,参与DNA甲基化等生物过程。人类MTHFR基因位于染色体1p36.3,其中有多个与MTHFR活性相关的SNP位点,例如G1965A、A1515C、C894T、以及C677T和A1298C等。MTHFR第677位碱基C>T变异(rs1801133),可导致MTHFR蛋白第222位的丙氨酸被缬氨酸取代,产生三种基因型:野生型(677CC),杂合变异型(677CT)和纯合变异型(677TT),在中国人群中的百分比分别为33%,44%和23%。与相比,杂合变异型(677CT)和纯合变异型(677TT)MTHFR酶活性与野生型(677CC)相比下降,为野生型的65%和30%,导致血清叶酸和维生素B12水平下降,同型半胱氨酸水平升高。MTHFR第1298位碱基A>C变异(rs1801131),可使MTHFR蛋白第433位的谷氨酰胺被丙氨酸取代,产生三种基因型:野生型(1298AA),杂合变异型(1298AC)和纯合变异型(1298CC),在中国人群中的百分比分别为66.8%,29.3%和3.9%。杂合变异型和纯合变异型MTHFR活性下降,可导致血浆中同型半胱氨酸水平升高。甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶,是叶酸代谢的关键酶之一。主要变异型有十余种,其中A66G是最主要和研究最多的突变。MTRR基因第66位碱基A>G变异(rs1801394),导致MTRR蛋白氨基酸链残基22位蛋氨酸被异亮氨酸替代,引起酶的活性降低,导致同型半胱氨酸血症,增加神经管畸形和先天性心脏病等出生缺陷性疾病的发病风险。其中野生型(66AA),杂合变异型(66AG)和纯合变异型(66GG)三种基因型在中国人群中百分比分别为58%,36%和6%。MTRR基因第一内含子c.56+781A>C多态(rs326119)的C等位基因可以降低MTRR基因的转录活性,导致MTRR的表达量下降,研究表明纯合变异型个体体内的同型半胱氨酸水平高于野生型个体,最终增加了先天性心脏病的易感性。甲硫氨酸还原酶(MTR)催化蛋氨酸合成的最终步骤,MTR基因位于1q43。MTR基因启动子区-186位碱基T>G多态(rs28372871)的G等位基因可以影响转录因子与基因启动子序列结合,降低MTR基因的转录活性,并且G等位基因可升高启动子区的甲基化水平,两方面相互作用最终引起MTR的表达量下降;大规模队列研究表明G等位基因是先天性心脏病的易感基因。MTR基因第2756位碱基A>G变异(rs1805087)可导致第919位氨基酸残基天冬氨酸被甘氨酸替代。大多数研究表明等位基因G可以导致个体的同型半胱氨酸水平下降,并且与多种肿瘤相关,但在中国人群中的研究并没有发现该变异与叶酸代谢异常及先天性心脏病相关。MTR基因下游+905位碱基G>A变异(rs1131450)位于基因的3’UTR位置,体外实验表明等位基因A可以通过影响miRNA的结合降低MTR的表达水平,导致同型半胱氨酸水平升高,从而增加了先天性心脏病的患病风险。胱硫醚β合酶(CBS)可以催化同型半胱氨酸形成胱硫醚,减轻同型半胱氨酸对机体的损害,是硫化反应的第一步。CBS基因位于21q22.3。CBS基因上游-551位碱基C>G变异(rs2850144)的G等位基因可以影响启动子与转录因子的结合,导致CBS的转录活性升高,表达量增加。虽然功能学研究并未发现G等位基因对同型半胱氨酸水平的影响,但在中国人群的病例对照研究和全基因组关联分析均表明,G等位基因对先天性心脏病的发生有保护作用。机体叶酸利用能力的先天性不足,引起叶酸缺乏时,需要对补充适当的叶酸,以维持机体机内正常的生物代谢。我国推荐孕期补充量为400微克/天,可以将显著降低患儿的出生缺陷,如能够降低NTDs(41%-85%),但是还有15%-59%却效果不明显,通过增加合适剂量的叶酸可以进一步降低NTDs。个性化补充叶酸,即让补充叶酸更具有针对性。专家建议:根据自己的遗传体质,在正确的时间补充合适剂量的叶酸。对MTHFR基因、MTRR基因及其相关位点的检测,可以直接发现被检测者叶酸代谢方面的遗传缺陷(即叶酸的利用能力),从而根据风险高低(相关代谢酶的活性程度)。如由专利技术人和中国疾病预防控制中心妇幼保健中心联合组织的孕期叶酸利用能力检测所提供的增补参考量:表1:孕期叶酸利用能力检测所提供的增补参考量表以上补充剂量指合成叶酸补充剂或强化剂的摄入量,不包括食物;对所有成年人包括孕妇和乳母,合成叶酸制剂的可耐受的最高摄入量(UL)设定为1000微克/天。因此800微克/天的叶酸制剂是安全的。对叶酸的增补剂量并非越多越好。大量研究发现,过量补充叶酸会导致以下不良后果:导致体内锌缺乏。锌是多种酶的活化剂,因此,孕母过量补充会导致胎儿生长缓慢,出生体重过低。叶酸作为合成核酸所必需的元素,是细胞生长和组织修复所必需的物质,更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素,有“优生优育的营养素”美誉,对孕妇尤其重要。据我国婚前育龄女性血清抽样调查发现,我国城市和农村女性缺乏叶酸者分别有21%和38%。据卫生部及疾控中心相关报告,我国每年有90万新生儿缺陷性疾病诞生,患出生缺陷排在前5位的包括:先天性心脏病,神经管畸形,唇腭裂,唐氏综合征,多指(趾),这些都与孕妇叶酸缺乏有一定关系。1997年卫生部开始推荐孕期女性统一补充叶酸,剂量为400μg/d,该措施在出生缺陷预防中起了重要作用。但由于孕妇对叶酸的代谢能力不足,出生缺陷的发生率仍存在很大的地域差异。对于叶酸代谢能力正常的孕妇来说,每天补充400μg叶酸是足够的,但是对叶酸代谢能力存在障碍的孕妇来说,应该相应增加补充剂量,并加强孕期各项检测。近年来的研究表明,叶酸代谢能力在个体间的差异与部分基因位点的多态性有关,具体位点包括本文档来自技高网...
用于叶酸代谢基因分型的核酸杂交膜条、PCR引物及试剂盒

【技术保护点】
一种用于叶酸代谢基因分型的核酸杂交膜条,其特征在于:包括基底,以及在所述基底上固定有特异性的多态检测探针对,每一对多态检测探针包括一条突变探针和一条正常探针,每一对多态检测探针分别对应一个叶酸代谢相关基因多态位点,所述相关基因多态位点包括以下位点中的至少一个:亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的c.677位点、c.1298位点;甲硫氨酸合成还原酶(MTRR)基因的c.56位点、c.66位点;甲硫氨酸合成酶(MTR)基因的‑186位点、c.2756位点、+905位点;胱硫醚‑β‑合成酶(CBS)基因的‑551位点;每一条所述突变探针和所述正常探针包含13‑25个碱基的序列,在所述序列的中部位置包含其相对应的叶酸代谢相关基因的多态碱基。

【技术特征摘要】
1.一种用于叶酸代谢基因分型的核酸杂交膜条,其特征在于:包括基底,以及在所述基底上固定有特异性的多态检测探针对,每一对多态检测探针包括一条突变探针和一条正常探针,每一对多态检测探针分别对应一个叶酸代谢相关基因多态位点,所述相关基因多态位点包括以下位点中的至少一个:亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的c.677位点、c.1298位点;甲硫氨酸合成还原酶(MTRR)基因的c.56位点、c.66位点;甲硫氨酸合成酶(MTR)基因的-186位点、c.2756位点、+905位点;胱硫醚-β-合成酶(CBS)基因的-551位点;每一条所述突变探针和所述正常探针包含13-25个碱基的序列,在所述序列的中部位置包含其相对应的叶酸代谢相关基因的多态碱基。2.根据权利要求1所述的核酸杂交膜条,其特征在于:所述突变探针为SEQIDNO.1,SEQIDNO.3,SEQIDNO.5,SEQIDNO.7,SEQIDNO.9,SEQIDNO.11,SEQIDNO.13,SEQIDNO.15中的至少一个序列或其反向互补序列的DNA;所述正常探针为SEQIDNO.2,SEQIDNO.4,SEQIDNO.6,SEQIDNO.8,SEQIDNO.10,SEQIDNO.12,SEQIDNO.14,SEQIDNO.16中的至少一个序列或其反向互补序列的DNA。3.根据权利要求1所述的核酸杂交膜条,其特征在于:所述多态检测探针的3’或5’端带有氨基标记。4.一种用于扩增待检样品基因片段的PCR引物,其特征在于:所述PCR引物的扩增产物含有权利要求1所述的基因多态位点,所述PCR引物为以下8对中的至少一对:SEQIDNO.17和EQIDNO.18;SEQIDNO.19和SEQIDNO.20;SEQIDNO.21和SEQIDNO.22;SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员:廖生赟郁俐蔡车国冯传欣邹发林张静
申请(专利权)人:深圳市亿立方生物技术有限公司
类型:发明
国别省市:广东,44

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