一种提高枯草芽孢杆菌普鲁兰酶分泌的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高枯草芽孢杆菌普鲁兰酶分泌的方法，属于发酵工程领域。本发明专利技术通过构建重组表达普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌，并在以此重组菌发酵生产普鲁兰酶的过程中，添加终浓度为0.4％的甜菜碱或0.2％的吐温‑80或0.4％的司盘80，普鲁兰酶的分泌效率可以达到76.13％、68.72％和72.84％，胞外pulA酶活分别达到22.95IU/ml、19.13IU/ml、20.11IU/ml。

A method for improving the secretion of pullulanase from Bacillus subtilis

The invention discloses a method for improving the pullulanase secretion of Bacillus subtilis, which belongs to the field of fermentation engineering. The present invention by recombinant pullulanase from Bacillus subtilis, and in the process of the production of recombinant pullulanase fermentation, adding a final concentration of 0.4% or 0.2% Twain betaine 80 or 0.4% span 80, pullulanase secretion efficiency can reach 76.13%, 68.72% and 72.84%, the extracellular pulA activity. At 22.95IU/ml, 19.13IU/ml, 20.11IU/ml respectively.

【技术实现步骤摘要】
一种提高枯草芽孢杆菌普鲁兰酶分泌的方法
本专利技术涉及一种提高枯草芽孢杆菌普鲁兰酶分泌的方法，属于发酵工程领域。
技术介绍
普鲁兰酶(EC3.2.1.41)是一种水解普鲁兰糖、支链淀粉等分支多糖类物质中α-1，6糖苷键的脱支淀粉酶。在工业生产中普鲁兰酶通常与α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、环糊精葡糖苷转移酶协同作用来获得葡萄糖、果糖、麦芽糖浆、环糊精、直链淀粉等产品。由于普鲁兰酶的加入可以明显提高这些产品的产量同时缩短生产周期，因此在低分子糖浆，啤酒，酒精燃料，抗性淀粉等物质的生产企业中应用广泛。然而普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的分泌量却相对较低，例如，重组菌株BacillussubtilisWB800-pMA0911-PUL表达了来源于Bacillusnaganoensis的普鲁兰酶，其胞外普鲁兰酶酶活仅为3.9U·ml-1，将载体pMA0911中的HpaII启动子用强启动子P43替换掉，胞外酶活提高到8.7U·ml-1，但分泌量仍然较低[WanSong,YaoNie,XiaoQingMu,YanXu,EnhancementofextracellularexpressionofBacillusnaganoensispullulanasefromrecombinantBacillussubtilis:Effectsofpromoterandhost.ProteinExpressionandPurification,2016,124:23-31]。再如，有研究者将枯草芽孢杆菌中用于表达普鲁兰酶的启动子和信号肽都进行优化，但胞外普鲁兰酶酶活仅为2.82U·ml-1，分泌量十分有限[Y.P.Wang,Y.H.Liu,Z.X.Wang,F.P.Lu,InfluenceofpromoterandsignalpeptideontheexpressionofpullulanaseinBacillussubtilis.BiotechnologyLetter,2014,36:1783-1789]，这就很大程度上限制了普鲁兰酶在工业生产中的应用。由于非离子型表面活性剂通常具有亲水基团和疏水集团，当这些集团与枯草芽孢杆菌的细胞壁和细胞膜接近时会破坏其肽聚糖，磷脂等物质的排列方式和结构，从而使细胞的透性增大。据我们所知，尚未有通过非离子型表面活性剂的添加来提高枯草芽孢杆菌中普鲁兰酶分泌效率的报道。本研究通过一些非离子型表面活性剂的添加和浓度的优化提高了枯草芽孢杆菌中普鲁兰酶的分泌效率，降低了工业上普鲁兰酶的胞外生产纯化成本。
技术实现思路
本专利技术首先提供了一种重组表达普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌，是以枯草芽孢杆菌WB800为宿主，以枯草芽孢杆菌168来源的启动子ylb(F4)替换掉pP43NMK上的启动子P43得到的载体作为表达载体，表达Anoxybacillussp.WB42来源的普鲁兰酶基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组表达普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法包括以下步骤：(1)将Anoxybacillussp.WB42来源的普鲁兰酶基因pulA和质粒pP43NMK同时用限制性内切酶KpnI和HindIII双酶切，纯化回收后的载体pP43NMK与目的基因pulA，进行连接得到pP43NMK-pulA；(2)以枯草芽孢杆菌168来源的启动子ylb(F4)替换掉pP43NMK-pulA上的启动子P43，得到pPylbNMK-pulA；(3)将重组质粒pPylbNMK-pulA转入枯草芽孢杆菌WB800菌株，得到重组表达普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌。本专利技术还提供应用所述重组枯草芽孢杆菌分泌表达普鲁兰酶的方法，是将重组枯草芽孢杆菌的种子液接种至LB液体培养基中，在35～37℃、180～200rpm培养，当菌体将要进入生长稳定期时，加入终浓度为0.4～0.6％的甜菜碱或0.2～0.4％的吐温-80或0.2～0.5％的司盘80。在本专利技术的一种实施方式中，将重组枯草芽孢杆菌的种子液按接种量1％接种至LB液体培养基中，在37℃，200rpm培养，当菌体将要进入生长稳定期时，加入终浓度为0.4％的甜菜碱或0.2％的吐温-80或0.4％的司盘80。本专利技术通过构建重组表达普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌，并在以此重组菌发酵生产普鲁兰酶的过程中，添加终浓度为0.4％的甜菜碱或0.2％的吐温-80或0.4％的司盘80，普鲁兰酶的分泌效率可以达到76.13％、68.72％和72.84％，胞外pulA酶活分别达到22.95IU/ml、19.13IU/ml、20.11IU/ml。附图说明图1基因片段pulAPCR产物的核酸电泳图图2启动子ylb(F4)PCR产物的核酸电泳图(3，4泳道)图3全质粒PCR产物pPylbNMK-pulA的核酸电泳图图4添加表面活性剂后BacillussubtilisWB800-pPylbNMK-pulA的生长曲线图5BacillussubtilisWB800-pPylbNMK-pulA发酵上清液SDS-PAGE(箭头所指为目的蛋白pulA，大小约84Kd)；1.对照，2.甜菜碱，3.甘氨酸，4.P-40，5.曲拉通X-100，6.吐温-80，7.十二烷基硫酸钠，8.月桂酰肌氨酸钠，9.司盘-80，10.S-185具体实施方式实施例1重组菌株BacillussubtilisWB800-pPylbNMK-pulA的构建(1)普鲁兰酶基因的克隆根据Anoxybacillussp.WB42来源的普鲁兰酶基因序列设计引物，引物如下：上游引物P1：GGGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGCTAACGGTTCATCGGACGTTTG，酶切位点为KpnI；下游引物P2：CCCAAGCTTTTAAGTCAGTCCTTTCACAAGCACGACTG，酶切位点为HindIII；扩增体系：模板1μL(Anoxybacillussp.WB42基因组DNA)上游引物P11μL下游引物P21μLdNTP(2.5mMeach)4μL5×PrimeSTARBuffer(Mg2+Plus)10μLPrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μL)0.5μLH2O32.5μL用于扩增目的基因的PCR条件：将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果附图1，其大小与目的基因大小相似，目的基因pulA序列见序列SEQIDNO.1。(2)E.coliJM109-pP43NMK-pulA重组菌株的构建用质粒小提试剂盒(TIANGEN公司)从E.coliJM109-pP43NMK中提取质粒pP43NMK(张晓舟.枯草杆菌新型表达系统和遗传操作体系的建立和应用[D].南京：南京农业大学，2006).将上述提取的目的基因pulA和质粒pP43NMK同时用限制性内切酶KpnI和HindIII双酶切，体系如下：KpnI1μLHindIII1μL10×QCBuffer2μLpulA/pP43NMK10μL人工序列H2O6μL酶切于37℃，反应4-6h即可，用DNA纯化试剂盒(TOYOBO公司)对DNA进行纯化回收。pP43NMK与目的基因pulA的连接：将上述纯化回收后的载体pP43NMK与目的基因pulA连接，体系如下：连接酶so本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组表达普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，是以枯草芽孢杆菌WB800为宿主，以枯草芽孢杆菌168来源的启动子ylb(F4)替换掉pP43NMK上的启动子P43得到的载体作为表达载体，表达Anoxybacillus sp.WB42来源的普鲁兰酶基因。

【技术特征摘要】
1.一种重组表达普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，是以枯草芽孢杆菌WB800为宿主，以枯草芽孢杆菌168来源的启动子ylb(F4)替换掉pP43NMK上的启动子P43得到的载体作为表达载体，表达Anoxybacillussp.WB42来源的普鲁兰酶基因。2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组表达普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法包括以下步骤：(1)将Anoxybacillussp.WB42来源的普鲁兰酶基因pulA和质粒pP43NMK同时用限制性内切酶KpnI和HindIII双酶切，纯化回收后的载体pP43NMK与目的基因pulA，进行连接得到pP43NMK-pulA；(2)以枯草芽孢杆菌168来源的启动子ylb(F4)替换掉pP43NMK-pulA上的启动子P43，得到pPylbNMK-pulA；(3)将重组质粒pPylbNMK-pulA转入枯草芽孢杆菌WB800菌株，得...

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，庞博，周丽，崔文璟，刘中美，郭军玲，刘黎明，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32