发酵生产3‑羟基丙酸基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种发酵生产3‑羟基丙酸基因工程菌及其构建方法与应用，本发明专利技术通过将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的乙醛脱氢酶基因和克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中的甘油脱水酶基因连接到原核表达载体pET30a(+)上，构建了pET30a‑ALDH‑DHAB双基因原核表达载体，并将之转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，构建了高效发酵生产3‑HP的基因工程菌，解决了化学工业合成3‑HP耗能高、污染严重，而微生物发酵生产3‑HP则产率低的问题。应用该工程菌发酵生产3‑HP，产量高达8.442g/L，工艺简单、便于工业化应用。

The fermentation production of 3 3-hydroxypropionic gene engineering strain and its construction method and Application

The invention discloses a fermentation production of 3 3-hydroxypropionic gene engineering strain and its construction method and application, the invention by yeast (Saccharomyces cerevisiae) and aldehyde dehydrogenase gene in Klebsiella pneumoniae (Klebsiella pneumoniae) - glycerol dehydratase in was connected to the prokaryotic expression vector pET30a (+), construct prokaryotic expression vector of pET30a ALDH DHAB double gene and transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) competentcells, gene engineering bacteria fermentation production efficiency for the construction of 3 HP, solves the synthesis of 3 HP chemical industry of high energy consumption, serious pollution, and microbial fermentation. 3 HP low yield problems. The application of the engineering bacteria fermentation production 3 HP, yield up to 8.442g/L, the process is simple and convenient for industrial application.

【技术实现步骤摘要】
发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及一种发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌，其构建方法及其应用，属于遗传工程领域。
技术介绍
3-羟基丙酸(3-hydroxypropionicacid,3-HP)，又名β-羟基丙酸，CAS号：503-66-2。3-HP是一种三碳弱有机酸，分子两端分别带有的一个羟基和一个羧基使其分子性质较为活泼，是近年来兴起的一种重要的化学中间体，可以作为生产1，3-丙二醇(PDO)、丁二酸，特种聚酯和丙烯酸的原料，可用于合成涂料、胶黏剂、水处理化学品和个人护理用品等多种化工产品及日用品，具有的重大的开发价值，使得其受到越来越多的关注。2004年美国能源部预测3-HP将是未来12种最具开发潜力的三碳化工产品之一。传统的3-HP生产工艺都是从化学工艺的角度出发的，具有能耗高、污染大、副产物多、分离困难等缺点，而生物方法生产3-HP可以有效地避免这些不利因素。因此，用生物方法制备3-HP成了现在国际上最注目的研究热点之一。生物法主要由一些野生菌株或基因工程菌等微生物经过一定方法改性后发酵得到3-HP。虽然早在上世纪60年代起，已经开始了利用野生菌株生物转化法制备3-HP的研究，但由于微生物细胞自我调节控制机制等限制了其的发展应用，使得利用野生菌株生物转化法制备3-HP的方法长期处于实验室范围内，而很难应用于工业生产。利用分子生物学技术可以实现特定外源基因在不同种属之间的转移、克隆以及表达，并可基于代谢工程原理构建高产目的产物的基因工程菌。因此利用基因工程技术是生物法生产3-HP的一重要途径。大肠杆菌表达系统是基因工程表达技术中发展最早，目前应用广泛的经典表达系统。与其他表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目标基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点。目前的研究主要通过构建以葡萄糖或甘油等廉价碳源物质作为底物来生产3-HP的基因工程菌株。目前的研究主要通过构建以葡萄糖或甘油等廉价碳源物质作为底物来生产3-HP的基因工程菌株。Cargill公司主要研究以葡萄糖为底物的生物转化途径，并于2002年将该研究成果申请专利。该研究主要是以大肠杆菌作为宿主菌进行厌氧发酵。Cargill通过基因克隆手段将存在于不同微生物体内的反应组合在一起，在宿主体内形成了一条以3-HP为代谢终产物的代谢路径，代谢途径中涉及到的关键酶都可以在KEGG代谢途径数据库中检索到。专利中对该途径当中的所有酶都做了详细说明，并且通过大量研究将大部分酶的酶活力活提高了50％-80％，从而提高了底物转化率。在以葡萄糖为底物转化生成3-HP的代谢路径中，转化率最高的是由存在于丙酸梭菌体内的β-丙氨酸代谢路径和橙色绿曲挠菌的3-羟基丙酸循环路径组合而成。这条路径中涉及到的3-羟基丙酰CoA脱水酶(OS19)基因来自于橙色绿曲挠菌，丙酸CoA转移酶(PCT)基因和乳酰CoA脱水酶(LCD)基因则是来自于埃氏巨球菌。据报道，底物葡萄糖通过该代谢途径的转化，最终3-HP的产量可达20g/L。但是该路径的构建也存在一定的难度。乳酰CoA脱水酶是一种对O2十分敏感的酶类，该酶结构中含有铁硫中心，很容易因被氧化而失活。有文献报道，该酶暴露于空气中60min，其酶活性将降低90％，所以这种性质给酶活的检测工作增加了难度，同时使得构建的基因工程菌发酵条件苛刻，必须在厌氧环境中进行。在以甘油为底物转化生产3-HP的代谢路径中，甘油在甘油脱水酶DHAB以维生素B12为辅酶作用下转化为中间产物3-HPA；3-HPA在醛脱氢酶的催化下生成3-HP，并生成还原当量NADH，产生的3-HP是细胞代谢终产物，可在发酵液中高度积累。该途径经过两步反应即可生成3-HP，且培养条件无需在严格的厌氧环境中。美国威斯康辛州研究基金会于上世纪末开始研究构建以甘油为底物的基因工程菌生产3-HP，并于2001年申请专利，该研究主要构建能利用甘油作为底物生产3-HP的基因工程菌，但3-HP产量不高。2008年，RajSM等以E.coliBL21(DE3)为宿主共表达了源于K.pneumoniaeDSM2026的甘油脱水酶DhaB和源于E.coliK-12MG1655的乙醛脱氢酶AldH，该重组菌可以直接利用甘油生产3-HP，但其产量仅为0.58g/L；RajSM等进一步优化了载体及诱导条件后，摇瓶情况下，3-HP的最高产量达到了4.4g/L。同时，国内的研究者们也对构建以甘油为底物的基因工程菌生产3-HP进行了试验研究。2008年，江南大学的黄瑞和许赣荣等将利用PCR方法从酿酒酵母克隆到的乙醛脱氢酶ALDH基因和克雷伯氏菌中的甘油脱水酶基因DHAB等两个基因分别构建了重组菌E.coliJM109(pUCtac-aldh)和E.coliJM109(pEtac-dhaB)，并将两种重组质粒共转化大肠杆菌E.coliJM109得到了重组大肠杆菌E.coliJM109(pUCtac-aldh，pEtac-dhaB)，该菌经发酵培养后，3-HP的产量达4.92g/L。2012年，胡南等以自身携带乙醛脱氢酶的E.coliBL21(DE3)plysS作为宿主，异源表达源自Klebsiellapneumoniae的甘油脱水酶基因dhaB后，重组菌E.coliHP在摇瓶条件下，3-HP的最大产量达5.44g/L。尽管众多的研究者们通过一系列的研究试验，构建了众多的以甘油为底物发酵生产3-HP的基因工程菌，在一定程度上提高了发酵生产3-HP的产量，但仍由于多种已知和未知的原因，以甘油为底物发酵产3-HP的量并未达到一个较为理想的状态，且发酵过程中甘油的利用率也需要进一步提高。因此转化甘油生产3-HP的基因工程菌还需要进一步的研究。研究构建新的转化甘油生产3-HP的基因工程菌，提高发酵生产3-HP的产量，提高底物甘油的利用率，为利用基因工程菌发酵生产3-HP的工业化生产提供新的资源，具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌，其构建方法及其应用。所述的发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌，它是包含有甘油脱水酶DHAB编码基因和乙醛脱氢酶ALDH编码基因的大肠杆菌。所述的甘油脱水酶DHAB编码基因来源于克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的乙醛脱氢酶ALDH编码基因来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W303A，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。根据本专利技术的另一个方面，所述的发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌的构建方法，通过聚合酶链式反应从克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)中扩增出甘油脱水酶DHAB编码基因，构建重组质粒克隆载体pMD18-T-DHAB，再对重组质粒克隆载体pMD18-T-DHAB和表达载体pET30a(+)分别用HindIII、SacI酶双酶切，将pMD18-T-DHAB切下的DHAB基因连接到载体pET30a(+)，构建表达载体pET30a-DHAB；通过通过聚合酶链式反应从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W303A中扩增出乙醛脱氢酶ALDH编码基因，构建重组质粒克隆载体p本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵生产3‑羟基丙酸基因工程菌，其特征在于，它为大肠杆菌(Escherichia coli)，其特征在于所述的大肠杆菌中含有乙醛脱氢酶基因ALDH和甘油脱水酶基因DHAB。

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌，其特征在于，它为大肠杆菌(Escherichiacoli)，其特征在于所述的大肠杆菌中含有乙醛脱氢酶基因ALDH和甘油脱水酶基因DHAB。2.根据权利要求1所述的发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌，其特征在于乙醛脱氢酶基因ALDH和甘油脱水酶基因DHAB以重组质粒的方式存在于大肠杆菌中，乙醛脱氢酶基因ALDH和甘油脱水酶基因DHAB存在于同一质粒中。3.根据权利要求2所述的发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌，其特征在于将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的乙醛脱氢酶基因和克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)中的甘油脱水酶基因连接到原核表达载体pET30a(+)上。4.根据权利要求1所述的发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌，所述的甘油脱水酶DHAB编码基因来源于克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示或与SEQIDNO.1具有99％以上同源性；所述的乙醛脱氢酶ALDH编码基因来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W303A，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示或与SEQIDNO.4具有99％以上同源性。5.权利要求1所述的发酵生产3-羟基丙酸基因工程菌的构建方法，其特征在于：(1)通过聚合酶链式反应从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W303A中扩增出乙醛脱氢酶基因ALDH，再将编码基因ALDH插入至载体pMD18-T，构建克隆载体pMD18-T-ALDH，再将pMD18-T-ALDH转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得pMD18-T-ALDH阳性转化子；和/或通过聚合酶链式反应从克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)中扩增出甘油脱水酶基因，再将编码基因DHAB插入载体pMD18-T，构建克隆载体pMD18-T-DHAB，再将pMD18-T-DHAB转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得pMD18-T-DHAB阳性转化子。(2)从步骤(1)中的pMD18-T-ALDH和pMD18-T-DHAB阳性转化子中提取pMD18-T-ALDH和pMD18-T-DHAB质粒；(3)将步骤(2)所述的pMD18-T-ALDH质粒和pET30a(+)...

【专利技术属性】
技术研发人员：张传丽，王陶，董玉玮，高明侠，李同祥，
申请(专利权)人：徐州工程学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32