一种产乳酸牛链球菌及其分离方法技术

本发明专利技术提供一种产乳酸牛链球菌，其核苷酸包括SEQ NO.1所示序列，以及该牛链球菌的分离方法如下：1)制备含有可溶性淀粉的富集培养基液，并将其高温灭菌除氧后密封冷却，调节pH为6.5到6.8；2)将无菌厌氧采集的菌源按照1：30～70的比例与步骤1)中制备所得的富集培养基液混合于厌氧培养容器中，于37℃震荡培养至少24小时后，竖立厌氧培养容器，继续静置培养至少24小时；3)制备分离培养基，高温灭菌除氧后在厌氧环境下冷却，调节pH为6.5到6.8后浇板；4)挑取步骤2)中培养容器中的沉淀物，涂布于分离培养板,在厌氧条件下37到39℃避光培养24到36小时，挑选表面湿润、有光泽、颜色为乳白色的圆滴状菌落，进行分离培养。该方法分离简单高效、选择性较强。

Staphylococcus aureus producing lactic acid and separating method thereof

The invention provides a method for producing lactic acid Streptococcus bovis, including SEQ NO.1 the nucleotide sequences shown below, as well as the S.bovis separation method: 1) liquid enrichment culture preparation containing soluble starch, and its high temperature sterilization after deaeraing seal cooling, adjusting pH to 6.5 to 6.8 to 2); according to the acquisition of anaerobic bacteria source sterile 1:30 ~ 70 and the proportion of step 1) in preparation of the enrichment medium in liquid mixed anaerobic culture container, 37 DEG C to shake culture for at least 24 hours after the erection of anaerobic culture vessel, to static culture for at least 24 hours; 3) was prepared from culture medium. High temperature sterilization after deaeraing cooling in the anaerobic environment, adjusting pH to 6.5 to 6.8 pouring plate; 4) out of step 2) in the culture vessel in sediment, coated on the isolation plate, under anaerobic conditions 37 to 39 DEG C light training 24 to 36 hours, pick the surface wet A colony of colonies with lustrous, creamy white colonies. The method is simple, efficient and selective.

【技术实现步骤摘要】
一种产乳酸牛链球菌及其分离方法
本专利技术涉及一种牛链球菌，尤其涉及一种能够利用淀粉发酵产出混合酸的产乳酸牛链球菌，以及该菌的体外分离方法，属于微生物

技术介绍
牛链球菌(Streptococcusbovis)是瘤胃主要的乳酸产生菌，在饲喂高精料饲粮导致瘤胃乳酸中毒的重要诱因。从反刍动物瘤胃中分离培养牛链球菌，研究其发酵产酸通路及主要影响因素将为寻找抑制其乳酸产生的方法(如：抑制型添加剂的研发等)提供理论参考，从而在生产上达到通过调控牛链球菌乳酸的产生来缓解反刍动物瘤胃乳酸中毒的目的。另外，利用牛链球菌产生混合酸的特点，可以将分离的瘤胃源牛链球菌用于反刍动物青贮饲料发酵，改进单纯使用乳酸菌作为发酵菌株的单一化的发酵模式。目前，有关牛链球菌的研究主要集中在检测瘤胃酸中毒情况下牛链球菌菌群数量变化情况。Wang,etal.研究结果发现，牛链球菌的数量在瘤胃酸中毒后剧增，直接揭示了其在诱导瘤胃酸中毒中的关键作用(WangH,PanX,WangC,etal.Effectsofdifferentdietaryconcentratetoforageratioandthiaminesupplementationontherumenfermentationandruminalbacterialcommunityindairycows[J].AnimalProductionScience,2015,55(2):189-193)。国外，特别是欧洲国家借助于高效的细菌库资源共享平台，研究开发了诸如莫能菌素等有效杀灭瘤胃牛链球菌的抗生素制剂(McGuffeyRK,RichardsonLF,WilkinsonJID.Ionophoresfordairycattle:currentstatusandfutureoutlook[J].JournalofDairyScience,2001,84:E194-E203)，以及有效刺激反刍动物产生抗牛链球菌抗体的疫苗等(ShuQ,BirdSH,GillHS,etal.Immunologicalcross-reactivitybetweenthevaccineandotherisolatesofStreptococcusbovisandLactobacillus[J].FEMSImmunology&MedicalMicrobiology,1999,26(2):153-158)，为在生产中预防和治疗瘤胃酸中毒提供了可行的解决方案。然而，由于牛链球菌能够感染人类引起相关炎症反应，使得从国外引进相关菌株存在一定风险，并且引进成本较为高昂。国内相关实验室开展了从瘤胃中分离培养牛链球菌的工作，但相关成功案例报道并不多见，主要是因为：(1)难营造严格厌氧环境：瘤胃源牛链球菌为厌氧菌，厌氧菌对分离、培养的厌氧环境要求较为严格，即使微量混入氧气不会导致其死亡，但长期可能具有引起其分化突变的可能，从而使得其厌氧下的部分功能丧失；(2)分选培养基没有选择性：分选培养基多以葡萄糖为能源，可以被几乎瘤胃所有细菌利用，部分与牛链球菌拮抗的细菌具有更强的葡萄糖竞争能力，从而抑制甚至产生毒害物质杀灭牛链球菌，导致牛链球菌的体外分离效率很低；(3)对牛链球菌菌斑特征的不熟悉，导致筛选过程中的漏选。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种产乳酸牛链球菌，该菌可以有很好地利用淀粉发酵产混合酸。本专利技术的目的还在于提供一种产乳酸牛链球菌的分离方法，该方法简单高效、选择性较强，解决了厌氧且具发酵淀粉产生乳酸的牛链球菌菌株分离没有特异性、分离效率低的难题。本专利技术的目的还在于提供上述产乳酸牛链球菌及其分离方法的应用。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种产乳酸牛链球菌，其核苷酸序列包括如序列表中所示SEQNO.1。本专利技术提供了一种如上所述的产乳酸牛链球菌的分离方法，主要包括如下步骤：(1)制备富集培养基液：以水为溶质，向其中加入质量比为1.0％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1.0％牛肉提取物，1.0％可溶性淀粉，0.2％K2HPO4，0.1％吐温80，0.02％MgSO4·7H2O，0.005％MgSO4·H2O，0.2％柠檬酸铵，0.5％C2H3NaO2，并向其中加入刃天青钠(终浓度为20mg/L)，作为厌氧指示剂，在将配置的富集培养基液高温灭菌除氧后密封冷却，调节pH为6.5到6.8。优选地，将配置的富集培养基液放于高压灭菌锅中115到121℃高压灭菌至少15分钟充分除氧后取出密封冷却。在富集培养基液组分中，以可溶性淀粉为唯一能源，使得无法利用淀粉的其他菌在富集培养基液中生长缓慢，而牛链球菌可以利用淀粉，迅速增殖，形成优势菌群。(2)菌源稀释将无菌厌氧采集的菌源按照1：30～70的比例与步骤(1)中所制备获得的富集培养基液混合于厌氧培养容器中，于37℃震荡培养至少24小时后，竖立厌氧培养容器，继续静置培养至少24小时。(3)制备固体分离培养基以水为溶质，向其中加入质量比为1.0％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1.0％牛肉提取物，1.0％可溶性淀粉，0.2％K2HPO4，0.1％吐温80，0.02％MgSO4·7H2O，0.005％MgSO4·H2O，0.2％柠檬酸铵，0.5％C2H3NaO2，并向其中加入1.5％琼脂糖，将配置的分离培养基高温灭菌除氧后在厌氧环境下冷却，调节pH为6.5到6.8后浇板。优选地，将配置的分离培养基放于高压灭菌锅中115到121℃高压灭菌至少15分钟后立即取出转移至厌氧工作站中冷却，调节pH为6.5到6.8，并浇板。(4)细菌的分离纯化吸弃步骤(2)中的培养容器中的培养液，保留沉淀物。因为牛链球菌菌体呈白色，且产乳酸后会发生聚集沉降。挑取少许沉淀，涂布于分离培养浇筑的培养板,优选琼脂培养板上，在厌氧条件下37到39℃避光培养24到36小时，挑选表面湿润、有光泽、颜色为乳白色的圆滴状菌落，进行产乳酸生化管鉴定和革兰氏染色鉴定，选择鉴定结果为产乳酸阳性及革兰氏阳性的菌落进一步转移至新的平板中分离培养。优选地，重复本步骤4次，分离得到纯菌株。本专利技术还提供了如上所述的产乳酸牛链球菌及其分离方法在开发牛链球菌疫苗以及新型饲料发酵菌剂方面的应用。本专利技术的技术方案的有益效果是：1)本专利技术提供的产乳酸牛链球菌的体外分离方法，能够简单高效、选择性较强地分离和筛选牛链球菌菌株。其中，以可溶性淀粉为唯一能源，使得无法利用淀粉的其他菌在富集培养基中生长缓慢，而使得牛链球菌可以利用淀粉，迅速增殖，形成优势菌群，相比于以葡萄糖作为能源的现有技术，本专利技术提供的分离方法对牛链球菌的选择性更强；此外，在菌源稀释步骤中，不同于现有技术中常用的“稀释富集培养液，然后接种到平板上”的分选方法，本专利技术中采用了竖立静置至少24小时的方法，通过竖立使得牛链球菌发生聚集下沉，并产生乳酸等形成粘液胶状白色沉淀，长时间的静置使得聚集下沉到底部，形成白色沉淀，以便进一步分选链球菌是直接挑选白色沉淀物进行分离培养，从而使得分选方法的目的性更强；另外，至少24小时的静置，使得牛链球菌发酵产生更多乳酸，pH进一步降低到4.5左右，此时几乎所有细菌都无法耐受此低pH而尽数死亡，但牛链球菌能耐受低pH，因此不会死亡，从而使得分离的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产乳酸牛链球菌，其特征在于，所述产乳牛链球菌的核苷酸包括如序列表中SEQ NO.1所示之序列。

【技术特征摘要】
1.一种产乳酸牛链球菌，其特征在于，所述产乳牛链球菌的核苷酸包括如序列表中SEQNO.1所示之序列。2.一种如权利要求1所述的产乳酸牛链球菌的分离方法，其特征在于，主要包括如下步骤：(1)制备富集培养基液：以水为溶质，向其中加入质量比为1.0％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1.0％牛肉提取物，1.0％可溶性淀粉，0.2％K2HPO4，0.1％吐温80，0.02％MgSO4·7H2O，0.005％MgSO4·H2O，0.2％柠檬酸铵，0.5％C2H3NaO2，并向其中加入终浓度为20mg/L的刃天青钠，在将配置的富集培养基液高温灭菌除氧后密封冷却，调节pH为6.5到6.8；(2)菌源稀释：将无菌厌氧采集的菌源按照1：30～70的比例与步骤(1)中所制备获得的富集培养基液混合于厌氧培养容器中，于37℃震荡培养至少24小时后，竖立厌氧培养容器，继续静置培养至少24小时；(3)制备固体分离培养基：以水为溶质，向其中加入质量比为1.0％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1.0％牛肉提取物，1.0％可溶性淀粉，0.2％K2HPO4，0.1％吐温80，0.02％MgSO4·7H2O，0.005％MgSO4·H2O，0.2％柠檬酸铵，0.5％C2H3NaO2，并向其中加入1.5％琼脂糖，在将配置的分离培养基高温灭菌除氧后在厌氧环...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洪荣，陈连民，王梦芝，喻礼怀，罗阳，沈宜钊，丁洛阳，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32