一种荧光染料及其合成与制备荧光探针的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种式(I)所示荧光染料及其合成与制备荧光探针的应用；本发明专利技术选用的喹啉结构是个双光子荧光团，利用方法学引入三氮唑具有良好的光稳定性以及很大的斯托克位移，且反应速度快。所合成的探针对硫化氢水溶液具有很好的特异性，穿透能力强，对细胞损伤小，能够检测细胞内硫化氢的浓度，最低检测限为2μM，为研究细胞中硫化氢的生理作用提供一种有效的研究工具。

Fluorescent dye and its synthesis and preparation of fluorescent probe

The invention discloses a type (I) application shown in fluorescent dye and its synthesis and preparation of fluorescent probe; quinoline structure of the invention is the selection of a two-photon fluorophore, using the methodology into three triazole has good light stability and large Storck shift, and fast response. The synthesized probe has good specificity of H2S solution, strong penetrating ability, little damage to the cells, is able to detect the intracellular concentration of H2S, the minimum detection limit of 2 M, provides an effective tool for studying the physiological role of hydrogen sulfide in cell research.

【技术实现步骤摘要】
一种荧光染料及其合成与制备荧光探针的应用(一)
本专利技术涉及一种新型荧光染料、合成方法及在硫化氢检测中的应用。(二)
技术介绍
荧光探针作为一种有效的、便捷的、快速的工具已经广泛的应用于小分子检测、蛋白质质分析、以及药物分析。目前主要的荧光染料有罗丹明、香豆素、荧光素等化合物。但这些化合物都存在其显著的缺点：细胞相容性差、合成困难、荧光强度低、难于修饰。因此对于新荧光染料的开发已经引起越来越多研究者的关注。这里我们基于8-氨基喹啉，利用C-H活性技术开发出了一种新型荧光染料，该染料具有荧光性能好、易于合成，易于修饰的特点。硫化氢是一种有臭鸡蛋味的小分子气体，与CO和NO属于同一类型的气体，现在被证实为第三个内源性气体信号分子，主要是通过三种酶产生：胱硫醚β-合酶(CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-MST)，存在人体的不同部位。目前研究的方法主要是开发新型的活细胞H2S荧光探针，通过荧光探针检测，可以在医学上有重要的突破，特别是对阿尔滋海默症、唐氏综合症、糖尿病等重大疾病。因此，开发出灵敏、高选择性、低背景的测量生物样本中H2S的方法对研究H2S的生物学功能具有重要意义。而叠氮和硫化氢的还原反应已经成为硫化氢检测的一种重要思路。基于一种新型、高灵敏、且具有一定抗肿瘤，抗阿尔海默茨病的三氮唑喹啉类荧光染料，我们设计合成了一种新型检测硫化氢探针，这类探针已经成功的应用于硫化氢浓度检测和细胞硫化氢检测。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种新型荧光染料及其在硫化氢检测中的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种式(I)所示新型荧光染料，式(I)中R1为C2-C10脂肪烷基、C5-C6杂环或取代芳基，其中取代基为卤素、C1-C6烷基或甲氧基，优选丁烷、噻吩或取代苯基，所述取代基为氯、甲氧基或乙基，更优选氯代苯基；R2为氢、甲氧基、C1-C10烷基或C2-C6共轭烯基，优选氢。更进一步，所述荧光染料为下列之一：本专利技术还提供一种所述荧光染料的制备方法，所述方法为：(1)将式(Ⅱ)所示化合物溶于体积浓度50％N,N-二甲基甲酰胺水溶液中，加入醋酸铜、过硫酸钾、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)、四丁基溴化铵(TBAB)和叠氮化钠，在20～60℃反应完全，反应液分离纯化，获得式(Ⅲ)所示化合物；所述N,N-二甲基甲酰胺水溶液体积用量以式(Ⅱ)所示化合物物质的量计为10～100ml/mol，优选100ml/mol；所述醋酸铜、过硫酸钾、DBU、TBAB和叠氮化钠与式(Ⅱ)所示化合物物质的量之比为0.1～5：1～5：1～5：1～5：1～5：1，优选0.3-3:1:1:3:1；(2)将式(Ⅲ)所示化合物溶于体积浓度50％有机溶剂水溶液中，加入碘化亚铜和炔基类化合物，在10～60℃(优选40-60℃)反应完全，反应液中加入饱和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过硫酸镁干燥、过滤、常温下旋转蒸除溶剂，即得粗品；将粗品进硅胶柱层析，以体积比为1：3-10的乙酸乙酯和石油醚的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，获得式(IV)所示化合物；所述有机溶剂为四氢呋喃或二甲基甲酰胺，所述炔基类化合物为C1～C10烷基，芳环，C5～C6杂环炔类化合物，优选苯乙炔、4-甲基苯乙炔、4-乙基苯乙炔、4-呋喃苯乙炔、4-甲氧基苯乙炔、己炔或4-氯苯乙炔；所述有机溶剂水溶液体积用量以式(Ⅲ)所示化合物物质的量计为10～100ml/mol，优选100ml/mol；所述碘化亚铜和炔基类化合物与式(Ⅲ)所示化合物物质的量之比为0.1～1.5：0.1～3：1，优选0.1-1:0.1-1:1；(3)将式(IV)所示化合物用无水乙醇溶解后与试剂混合，在60-120℃(优选80℃)反应完全，反应液中加入饱和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过硫酸镁干燥、过滤、常温下旋转蒸除溶剂，即得粗品；将粗品进硅胶柱层析，以体积比为1：3-10的乙酸乙酯和石油醚的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，获得式(I)所示化合物；所述无水乙醇体积用量以式(IV)所示化合物的物质的量计为0.10～6L/mol，优选0.67L/mol；所述试剂为氢氧化钾或1-3mol/L盐酸水溶液，所述氢氧化钾与式(IV)所示化合物的物质量比为1～3：1，所述盐酸水溶液体积用量以式(IV)所示化合物物质的量计为10～60ml/mol；式(Ⅱ)中，R2为氢、甲氧基、C1-C10烷基或C2-C6共轭烯基，R3为C2-C13苯基、C2-C10脂肪烷基、C5-C6取代芳基，C5-C6杂环、氨基酸、叔丁氧羰基，芴甲氧羰基；其中取代基为卤素、C1-C6烷基或甲氧基；式(Ⅲ)中R2和R3同式(Ⅱ)；式(IV)中R1为C2-C10脂肪烷基、C5-C6杂环或取代芳基，其中取代基为卤素、C1-C6烷基或甲氧基；R2和R3同式(Ⅱ)；式(I)中R1、R2和R3同式(IV)。进一步，步骤(1)反应液分离纯化方法为：反应结束后，反应液中加入饱和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过干燥、过滤、蒸干，获得浓缩物；取浓缩物进行硅胶柱层析，以体积比为1：10的乙酸乙酯和石油醚的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.5-0.7的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到式(Ⅲ)所示化合物。此外，本专利技术还提供一种所述荧光染料在制备式(Ⅴ)所示硫化氢探针中的应用；式(Ⅴ)中R1为C1-C10脂肪烷基、C5-C6杂环或取代芳基，其中取代基为卤素、C1-C6烷基或甲氧基，优选对氯苯基；R2为氢、甲氧基、C1-C10烷基或C2-C6共轭烯基，优选氢。进一步，所述硫化氢探针为：进一步，所述硫化氢探针按如下方法制备：将式(I)所示荧光染料溶于乙醇，冰浴下加入1-3mol/L盐酸水溶液和亚硝酸钠，0～40℃反应2h，接着加入叠氮化钠，0～40℃继续反应完全，反应液纯化，得到式(Ⅴ)所示硫化氢探针；所述乙醇体积用量以式(I)所示荧光染料物质的量计为1～6L/mmol，优选1L/mmol；所述盐酸水溶液体积用量以式(I)所示荧光染料物质的量计为0.1～5L/mmol，优选0.5L/mmol；所述亚硝酸钠和叠氮化钠与式(I)所示荧光染料物质的量之比为2：3：1。本专利技术还提供了一种硫化氢检测的方法：所述硫化氢浓度为2μmol-5mmol的硫化氢溶液。将待测硫化氢样品，pH值为7.4的PBS缓冲液中得到硫化氢的100mM样品溶液，取待测硫化氢样品1μl，加入含荧光探针溶液，得到反应液，充分混匀，反应液立即加入96孔筛板中，观测荧光强度变化，测其荧光强度。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术选用的喹啉结构是个双光子荧光团，利用方法学引入三氮唑具有良好的光稳定性以及很大的斯托克位移，且反应速度快。所合成的探针对硫化氢水溶液具有很好的特异性，穿透能力强，对细胞损伤小，能够检测细胞内硫化氢的浓度，最低检测限为2μM，为研究细胞中硫化氢的生理作用提供一种有效的研究工具。(四)附图说明图1pH7.4下加入0μM和100μM硫化氢浓度的荧光探针紫外吸收光谱。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种式(I)所示荧光染料，

【技术特征摘要】
1.一种式(I)所示荧光染料，式(I)中R1为C2-C10脂肪烷基、C5-C6杂环或取代芳基，其中取代基为卤素、C1-C6烷基或甲氧基；R2为氢、甲氧基、C1-C10烷基或C2-C6共轭烯基。2.如权利要求1所述荧光染料，其特征在于所述R1为丁烷、噻吩或取代苯基，所述取代基为氯、甲氧基或乙基，R2为氢。3.如权利要求1所述荧光染料，其特征在于所述荧光染料为下列之一：4.一种权利要求1所述荧光染料的制备方法，其特征在于所述方法为：(1)将式(Ⅱ)所示化合物溶于体积浓度50％N,N-二甲基甲酰胺水溶液中，加入醋酸铜、过硫酸钾、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、四丁基溴化铵和叠氮化钠，在20～60℃反应完全，反应液分离纯化，获得式(Ⅲ)所示化合物；所述N,N-二甲基甲酰胺水溶液体积用量以式(Ⅱ)所示化合物物质的量计为10-100ml/mol；所述醋酸铜、过硫酸钾、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、四丁基溴化铵和叠氮化钠与式(Ⅱ)所示化合物物质的量之比为1～5：1～5：1～5：1～5：1～5：1；(2)将式(Ⅲ)所示化合物溶于体积浓度50％有机溶剂水溶液中，加入碘化亚铜和炔基类化合物，在10～60℃反应完全，反应液中加入饱和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过硫酸镁干燥、过滤、常温下旋转蒸除溶剂，即得粗品；将粗品进硅胶柱层析，以体积比为1：3-10的乙酸乙酯和石油醚的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，获得式(Ⅳ)所示化合物；所述有机溶剂为四氢呋喃或二甲基甲酰胺，所述炔基类化合物为C1～C10烷基，芳环，C5～C6杂环炔类化合物；所述有机溶剂水溶液体积用量以式(Ⅲ)所示化合物物质的量计为10～100ml/mol；所述碘化亚铜和炔基类化合物与式(Ⅲ)所示化合物物质的量之比为0.1～1.5：0.1～3：1；(3)将式(Ⅳ)所示化合物用无水乙醇溶解后与试剂混合，在60-120℃反应完全，反应液后处理，获得式(I)所示化合物；所述无水乙醇体积用量以式(Ⅳ)所示化合物的物质的量计为0.10～6L/mol；所述试剂为氢氧化钾或1-3mol/L盐酸水溶液，所述氢氧化钾与式(Ⅳ)所示化合物的物质的量比为1～3：1，所述盐酸水溶液体积用量以式(Ⅳ)所示化合物物质的量计为10～60ml/mol；其中，式(Ⅱ)中，R2为氢、甲氧基、C1-C10烷基或C2-C6共轭烯基，R3为苯基、C2-C10...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱勍，窦言东，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33