用于将植物材料基因分型的体系和方法技术

本发明专利技术提供了用于从植物胚获得遗传物质，同时保持它们活性的方法，以及用于对植物胚，尤其是具有少量遗传物质的植物胚进行分子分析的方法。所述方法可包括从一个或多个植物胚收集脱落的细胞材料的步骤；从所述脱落的细胞材料获得DNA；进行所述DNA的分子分析；以及使所述一个或多个植物胚中的至少一个发芽。该方法的进一步延伸包括确定所述胚是否发芽和生长，或是否基于胚的基因型而丢弃它，作为育种过程的一部分。还提供了使用包含在琼脂之中或之上的胚脱落细胞材料对胚进行基因分型的方法，和分析来源于小孢子的植物胚组织的方法。

System and method for genotyping plant materials

The present invention provides methods for obtaining genetic material from plant embryos while maintaining their activity, and methods for molecular analysis of plant embryos, especially plant embryos having a small amount of genetic material. The method can include from one or more plant embryos collected from the cell material steps; off from the cell material DNA; molecular analysis of the DNA; and the at least one germination one or more plants in the embryo. Further extensions of the method include determining whether the embryo is budding and growing, or whether the embryo is discarded based on the genotype of the embryo as part of the breeding process. Also provided are methods for genotyping embryos by using embryonic exfoliated cell material contained in or above agar, and methods for analyzing plant embryo tissue derived from microspores.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于将植物材料基因分型的体系和方法相关专利申请的交叉引用本专利技术申请要求2014年8月29日提交的美国国家专利申请14/473,114的权益，所述文献全文以引用方式并入本文。
技术介绍
遗传、生化或表型分析所使用的现有传统种子分析法需要至少取出并且加工种子的一部分。在取出一些种子组织时，可能需要满足各种目标。这些目标可包括以下目标的一项或多项：(a)如果需要，在收集种子组织后保持种子的活力。(b)获得至少最小所需量的组织，而不影响活力。(c)从种子上的特定位置获得组织，通常需要将种子定向在特定位置的能力。(d)为了效率目的，维持特定的吞吐量水平。(e)减少或几乎消除污染。(f)允许跟踪分离的组织及其与获得组织的种子的相关性。传统种子测试技术并未充分解决这些需求，从而对资金和劳动力资源造成压力，因此说明需要改善现有技术水平。当前方法的吞吐量相对较低、存在相当大的交叉污染风险，并且因依赖于显著的手工处理、定向和从种子上除去组织而倾向于不一致。这可影响从种子取得的组织的类型和种子发芽的可能性。需要消除当前方法在移除种子组织各个部分之间进行清洁所需的资源。还需要减少或最小化通过携带或其它原因测试的独特组织部分之间的交叉污染，或任何其它组织的任何来源的任何污染。此外，需要更高的可靠性和准确性。此外，上面示出的一些目标可能是冲突的，甚至是对立的。例如，获得可用量的组织，同时保持种子活力，需要取一些种子组织，但不是太多。此外，高吞吐量方法涉及快速操作，但是可能伴随精确度的降低和污染的风险增加，使得所述方法必须比技术上所可能的更慢地进行以克服所述限制。因此，这些多个目标存在于本领域中，并且没有被当前可用的方法和装置令人满意地解决或平衡。在本领域中需要克服上述类型的问题，使得实现最大数目的目标。
技术实现思路
本专利技术包括用于分析植物材料，同时保持植物材料活力(即形成植物的能力)的方法。所述方法可包括以下步骤：从一个或多个植物胚(或从来源于小孢子的植物胚组织)收集脱落的细胞材料；从脱落的细胞材料获得遗传物质如DNA；以及进行遗传物质的分子分析。所述方法还可包括使所述一个或多个植物胚中的至少一个发芽。胚可从种子获得，或可通过体细胞或配子(小孢子)胚形成而来源于其它组织。在一个实施方案中，通过在非破坏性培养基如水或其它水性溶液中搅动胚，从胚收集脱落的细胞材料。搅拌可以通过本领域普通技术人员已知的任何方式进行。在另一个实施方案中，通过获得与植物胚接触的琼脂的一部分来收集植物胚的脱落的细胞材料，其中所述部分包含植物胚的脱落的细胞材料。可将部分琼脂放置于基本上由水或TE组成的非破坏性培养基中，并且可使用本领域普通技术人员已知的任何方法进行搅拌。所述方法还可包括从琼脂除去胚，并且使用本文提供的方法储存胚或将胚转移至发芽培养基。植物胚可为单倍体胚，并且琼脂可包含染色体加倍剂，如但不限于秋水仙碱。因此，植物胚可变成双倍单倍体。在另一个实施方案中，可使用滤纸代替琼脂。在上述任何方法中，可通过将所收集的脱落的细胞材料暴露于冷却，然后加热，接着搅拌，从脱落的细胞材料获得DNA；可重复所述步骤。在其它实施方案中，可通过加热脱落的细胞材料并且搅拌，从脱落的细胞材料获得DNA；可重复所述步骤。在其它实施方案中，可通过用酶培养脱落的细胞材料获得DNA；所述酶可为L，一种包含宽泛范围的糖酶的多酶复合物，包括阿拉伯糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、和木聚糖酶。(参见SigmaAldrich产品目录)。在其它实施方案中，可使用DNA提取技术获得DNA，如但不限于使用结合遗传物质的磁性颗粒或本领域普通技术人员已知的任何方法。方法包括从胚(或来源于小孢子的胚组织)的脱落细胞材料获得遗传物质，并且对遗传物质进行分子分析，同时保持胚发芽的能力。分子分析可为基因分型，其可通过以下方式发生：单核苷酸多态性检测、限制性片段长度多态性识别、随机扩增多态性检测、扩增片段长度多态性检测、聚合酶链式反应、DNA测序、全基因组测序、等位基因特异性寡核苷酸探针、或者DNA与DNA微阵列或小珠的杂合。可在分子分析之前进行全基因组扩增。在其它实施方案中，一个或多个步骤可以是自动的。在一些实施方案中，可通过将胚或胚组织悬浮在由一种或多种油的基质包围的水性溶液中，来储存胚。优选地，一种或多种油中的至少一种具有大于水性溶液的密度。胚或胚组织的储存可在从胚或胚组织收集脱落的细胞材料之前或之后发生。在一些方面，可将抗微生物剂和/或最小生长培养基加入到水性溶液中。在其它方面，胚或胚组织可在冷却(优选4℃)和/或黑暗条件下储存以防止过早发芽。在一些实施方案中，可转移胚或胚组织以连续储存。在其它实施方案中，可将胚转移至发芽培养基中，并且可使一个或多个胚发芽。在其它实施方案中，可除去水性溶液的等分试样，可从等分试样中的细胞材料获得遗传物质，并且遗传物质可用于分子分析(例如对储存的胚进行基因分型)。分子分析可为基因分型，其可通过以下方式发生：单核苷酸多态性检测、限制性片段长度多态性识别、随机扩增多态性检测、扩增片段长度多态性检测、聚合酶链式反应、DNA测序、全基因组测序、等位基因特异性寡核苷酸探针、或者DNA与DNA微阵列或小珠的杂合。在其它实施方案中，上述步骤中的一个或多个可以是自动的。方法包括获得胚DNA(无论所述获得胚DNA是否包括提取)，以保存胚发芽和长成植物的能力的方式储存从中提取DNA的胚，使用胚DNA对胚进行基因分型，以及确定是否使胚发芽和生长(即选择)或基于其基因型丢弃胚(即反选择)。基于其基因型选择发芽和生长的胚可长成植物并且表型，用于育种，或用于扩增相同基因型的种子。在优选的实施方案中，所述方法的一个或多个步骤可以是自动的。一个实施方案允许通过从一个或多个种子收集母本种子组织来确定一个或多个种子的母系谱系；洗涤母本种子组织；解离并且均化母本种子组织以获得均化溶液；离心所述均化的溶液以获得上清液；并且使用上清液DNA进行分子分析。在一个实施方案中，母本种子组织是果皮。洗涤步骤可用1％十二烷基硫酸钠溶液、水、乙醇或它们的混合物进行。洗涤步骤优选用约1％十二烷基硫酸钠的水溶液进行。解离并且破碎果皮组织可使用细胞解离器(例如gentleMACSTM，MiltenyiBiotech)进行。所述方法还可包括在分子分析之前使用全基因组扩增以获得足够的DNA产量。另一个实施方案允许通过从一个或多个种子收集母本种子组织来确定一个或多个种子的母系谱系；洗涤母本种子组织；解离并且均化母本种子组织以获得均化溶液；从均化溶液中包含的细胞提取DNA；并且对所提取的DNA进行分子分析。在一个实施方案中，母本种子组织是果皮。洗涤步骤可用1％十二烷基硫酸钠溶液、水、乙醇或它们的混合物进行。洗涤步骤优选用约1％十二烷基硫酸钠的水溶液进行。解离和均化步骤可使用细胞解离器(例如gentleMACSTM，MiltenyiBiotech)进行。提取步骤可使用DNA结合磁性颗粒或Extract-N-AmpTM进行。所述方法还可包括在分子分析之前使用全基因组扩增以获得足够的DNA产量。另一个实施方案允许通过从一个或多个种子收集母本种子组织来确定一个或多个种子的母系谱系；洗涤母本种子组织；在液氮中破坏母本种子组织；从破碎的母本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分析一个或多个植物胚的方法，所述方法包括：(a)通过在非破坏性培养基中搅拌一个或多个植物胚来从所述一个或多个植物胚收集脱落的细胞材料；(b)从所述脱落的细胞材料获得DNA；以及(c)对步骤(b)中获得的所述DNA进行分子分析。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.29 US 14/4731141.一种分析一个或多个植物胚的方法，所述方法包括：(a)通过在非破坏性培养基中搅拌一个或多个植物胚来从所述一个或多个植物胚收集脱落的细胞材料；(b)从所述脱落的细胞材料获得DNA；以及(c)对步骤(b)中获得的所述DNA进行分子分析。2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括(d)使所述一个或多个植物胚中的至少一个发芽成植物。3.根据权利要求1所述的方法，其中通过将所收集的脱落的细胞材料暴露于冷却，然后加热，接着搅拌，来获得所述DNA。4.根据权利要求3所述的方法，其中将所述冷却、加热和搅拌步骤重复。5.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在步骤(a)之前或之后，储存所述一个或多个植物胚。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子分析是基因分型。7.根据权利要求6所述的方法，所述方法还包括基于基因型来选择一个或多个植物胚。8.根据权利要求7所述的方法，其中导致选择一个或多个植物胚的任何所述步骤是自动化的。9.一种分析植物胚的方法，所述方法包括：a.获得与植物胚接触的琼脂的一部分，其中所述部分包含所述植物胚的脱落的细胞材料；b.从所述植物胚的所述脱落的细胞材料获得遗传物质；以及c.对从所述植物胚的所述脱落的细胞材料获得的所述遗传物质进行分子分析。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述琼脂包含染色体...

【专利技术属性】
技术研发人员：R阿诺德，MP科佩，JA沙雷斯，Y韫，
申请(专利权)人：先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：美国,US