核酸扩增制造技术
Nucleic acid amplification
Methods and compositions for nucleic acid amplification and multi body formation are disclosed herein. The amplification methods provided herein can be performed under isothermal conditions. Methods and compositions may include reagents such as nucleic acids, polymerases, and primers.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸扩增
技术介绍
对于用于核酸扩增的方法和试剂的需求日益增加。生成特定核酸的多个拷贝通常是必要的或有用的，以便核酸可用于给定的应用。例如，为了分析感兴趣的核酸的核苷酸序列，在分析该序列之前经常复制核酸以增加它的拷贝数。在另一个实例中，为了确定样品中特定核酸的存在或不存在，可在一定条件下处理样品以使得如果特定核酸存在于该样品中则它可被扩增。在另一个实例中，用作探针的核酸可进行重复拷贝以生成大量含有与原始核酸模板相同的序列的核酸，从而生成核酸的许多拷贝，该拷贝可用作探针。已知多种用于核酸扩增的方法。例如，聚合酶链反应(“PCR”)(参见，例如，美国专利号4,683,202)是一种用于核酸扩增的普遍方法。为了成功地进行PCR反应，该反应必须在重复多个循环的多个不同温度下进行。这需要用于重复地改变PCR反应的温度的硬件或其他机构。用于核酸扩增的另一种方法被称为环介导等温扩增(“LAMP”)(参见，例如，美国专利号6,410,278)。LAMP反应可在等温下进行，但通常包括四种不同引物的使用，这些引物识别靶核酸上总计六种不同的序列。为促进生成扩增的核酸以用于使用扩增的核酸的多个和增加数量的应用，需要用于核酸扩增的新的方法和试剂。援引并入本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而以相同程度并入本文，犹如特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。然而，在本公开的内容与本文通过引用并入的文献的内容之间冲突的情况下，以本公开的内容为准。
技术实现思路
本文提供了涉及核酸扩增和多联体生成的方法和组合物。在一些实施方式中，本文提供了用于生成包含双链核...
【技术保护点】
一种拷贝多核苷酸模板的方法，该方法包括：在包含第一引物和第二引物的反应混合物中温育该多核苷酸模板，其中：第一引物包含第一区域和第二区域，其中第一引物的第二区域包含与该多核苷酸模板的第一部分互补的核苷酸序列；第二引物包含第一区域和第二区域，其中第二引物的第二区域包含与配偶体核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中该配偶体核苷酸序列与该多核苷酸模板的第二部分互补；并且在该多核苷酸模板与第一引物和第二引物一起温育时，形成至少一条多联体链，其中该多联体链包含5’端和3’端，并且包含具有5’至3’方向的通用结构C’‑T‑C’‑T‑X‑C’的核苷酸序列，其中：C’表示第二引物的第一区域的核苷酸序列，T表示该多核苷酸模板的核苷酸序列或其类似序列，且X表示任何数目和序列的核苷酸。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.15 US 61/800,6061.一种拷贝多核苷酸模板的方法，该方法包括：在包含第一引物和第二引物的反应混合物中温育该多核苷酸模板，其中：第一引物包含第一区域和第二区域，其中第一引物的第二区域包含与该多核苷酸模板的第一部分互补的核苷酸序列；第二引物包含第一区域和第二区域，其中第二引物的第二区域包含与配偶体核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中该配偶体核苷酸序列与该多核苷酸模板的第二部分互补；并且在该多核苷酸模板与第一引物和第二引物一起温育时，形成至少一条多联体链，其中该多联体链包含5’端和3’端，并且包含具有5’至3’方向的通用结构C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列，其中：C’表示第二引物的第一区域的核苷酸序列，T表示该多核苷酸模板的核苷酸序列或其类似序列，且X表示任何数目和序列的核苷酸。2.如权利要求1所述的方法，其中所述多联体链是第一多联体链，并且其中在所述多核苷酸模板与第一引物和第二引物一起温育时，还形成了第二多联体链，其中第二多联体链包含5’端和3’端，并且包含具有5’至3’方向的通用结构C-X’-T’-C-T’-C的核苷酸序列，其中：C表示第一引物的第一区域的核苷酸序列，T’表示与多核苷酸模板互补的核苷酸序列，且X’表示与X的核苷酸序列互补的核苷酸序列。3.如权利要求1所述的方法，其中X含有具有5’至3’方向的通用结构[(C’-T)N]的序列，其中C’表示第二引物的第一区域的核苷酸序列，T表示多核苷酸模板的核苷酸序列或其类似序列，且N为0至1000之间的任何整数。4.如权利要求1所述的方法，其中X表示0个核苷酸。5.如权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含具有链置换活性的DNA聚合酶。6.如权利要求5所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含逆转录酶。7.如权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸模板是RNA分子。8.如权利要求7所述的方法，其中T表示与所述多核苷酸模板的RNA序列类似的DNA序列的核苷酸序列。9.如权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸模板包含双链核酸模板的一条链。10.如权利要求1所述的方法，其中在所述反应混合物的温育过程中，反应混合物的温度不超过80℃。11.如权利要求1所述的方法，其中所述第一引物的第一区域含有4至25个核苷酸。12.如权利要求1所述的方法，其中所述第一引物的第一区域和所述第二引物的第一区域含有相同数目的核苷酸。13.如权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸模板含有10至1000个核苷酸。14.如权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含核酸染料。15.如权利要求1所述的方法，其中在该方法开始后60分钟内，所述反应混合物中的多核苷酸模板的拷贝数增加至少10倍。16.一种测定生物样品中的靶多核苷酸模板的方法，该方法包括：A)在包含第一引物和第二引物的反应混合物中温育该生物样品或其部分，其中：第一引物包含第一区域和第二区域，其中第一引物的第二区域包含与该多核苷酸模板的第一部分互补的核苷酸序列；第二引物包含第一区域和第二区域，其中第二引物的第二区域包含与配偶体核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中该配偶体核苷酸序列与多核苷酸模板的第二部分互补；并且在多核苷酸模板与第一引物和第二引物一起温育时，形成至少一条多联体链，其中该多联体链包含5’端和3’端，并且包含具有5’至3’方向的通用结构C’-T-C’-T-X-C’的核苷酸序列，其中：C’表示第二引物的第一区域的核苷酸序列，T表示多核苷酸模板的核苷酸序列或其类似序列，且X表示任何数目和序列的核苷酸；以及B)在A)的温育步骤开始后在一个或多个点测量A)的反应混合物中扩增的核酸的量。17.如权利要求16所述的方法，其中测量反应混合物中扩增的核酸的量包括确定反应混合物中的荧光的水平。18.如权利要求16所述的方法，其进一步包括确定反应混合物中的核酸扩增的转变时间。19.如权利要求16所述的方法，其中所述生物样品或其部分来自人。20.一种生成包含双链核酸模板的至少两个拷贝的多联体的方法，该方法包括：在反应混合物中温育至少第一模板分子和第二模板分子，其中：第一模板分子包含第一核酸链和第二核酸链，其中：第一模板分子的第一核酸链包含具有5’至3’方向的通用结构H’-S-Y1-H’的核苷酸序列，其中：H’表示第一同源序列的核苷酸序列，S表示双链核酸模板的第一链的核苷酸序列，且Y1表示任何数目和序列的核苷酸；并且第一模板分子的第二核酸链包含具有5’至3’方向的通用结构H-Y1’-S’-H的核苷酸序列，其中：H表示第二同源序列的核苷酸序列，其中第一同源序列与第二同源序列彼此互补，Y1’表示与Y1的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且S’表示双链核酸模板的第二链的核苷酸序列，其中双链核酸模板的第一链和第二链彼此互补；并且第二模板分子包含第一核酸链和第二核酸链，其中：第二模板分子的第一核酸链包含具有5’至3’方向的通用结构H’-S-Y2-H’的核苷酸序列，其中：H’表示第一同源序列的核苷酸序列，S表示双链核酸模板的第一链的核苷酸序列，且Y2表示任何数目和序列的核苷酸；且第一模板分子的第二核酸链包含具有5’至3’方向的通用结构H-Y2’-S’-H的核苷酸序列，其中：H表示第二同源序列的核苷酸序列，Y2’表示与Y2的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且S’表示双链核酸模板的第二链的核酸序列；并且在反应混合物中的第一模板分子与第二模板分子一起温育时，形成包含双链核酸模板的至少两个拷贝的至少一个多联体，其中该多联体包含第一多联体链和第二多联体链，其中第一多联体链包含5’端和3’端，并包含具有5’至3’方向的通用结构H’-S-Y2-H’-S-Y1-H’的核苷酸序列，其中H’、Y1、S和Y2中的每一个均表示如上所述的核苷酸序列；并且其中第二多联体链包含5’端和3’端，并包含具有5’至3’方向的通用结构H-Y1’-S’-H-Y2’-S’-H的序列，其中，H’、Y1、S和Y2中的每一个均表示如上所述的核苷酸序列。21.如权利要求20所述的方法，其中Y1和Y2中的至少一个表示0个核苷酸。22.如权利要求21所述的方法，其中Y1和Y2均表示0个核苷酸。23.如权利要求20所述的方法，其中Y1含有具有5’至3’方向的通用结构[(H’-S)N1]的序列，其中H’表示第一同源序列的核苷酸序列，S表示双链核酸模板的第一链的核苷酸序列，且N1是0至2000之间的任何整数。24.如权利要求20所述的方法，其中Y1含有具有5’至3’方向的通用结构[(H’-S)N1]的序列，其中H’表示第一同源序列的核苷酸序列，S表示双链核酸模板的第一链的核苷酸序列，且N1是0至2000之间的任何整数，并且其中Y2含有具有5’至3’方向的通用结构[(H’-S)N2]的序列，其中H’表示第一同源序列的核苷酸序列，S表示双链核酸模板的第一链的核苷酸序列，且N2是0至2000之间的任何整数。25.如权利要求24所述的方法，其中N1和N2是不同的整数。26.如权利要求25所述的方法，其中N1为0，且N2是1至2000之间的整数。27.如权利要求20所述的方法，其中第一模板分子和第二模板分子均为双链DNA分子。28.如权利要求20所述的方法，其中第一同源序列含有4至25个核苷酸。29.一种生成包含双链核酸模板的两个或更多个拷贝的多联体的方法，该方法包括：(A)在使得合成与双链核酸模板的第一链退火的第一引物的第一拷贝的延伸产物的条件下，用第一引物的第一拷贝和聚合酶处理包含双链核酸模板的一级双链核酸，其中第一引物包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：(i)尾区，其包含：(a)引物的5’末端核苷酸(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游(c)5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，以及(ii)模板结合区，其包括(a)引物的3’末端核苷酸(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在3’末端核苷酸的上游(c)3’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，并且第一引物的第一拷贝的模板结合区与双链核酸模板的第一链退火，(B)在使得合成与步骤(A)的第一引物的第一拷贝的延伸产物退火的第二引物的延伸产物的条件下，用第二引物和聚合酶处理步骤(A)的第一引物的第一拷贝的延伸产物，其中第二引物包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：(i)尾区，其包含(a)引物的5’末端核苷酸(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游(c)5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，以及(ii)模板结合区，其包含(a)引物的3’末端核苷酸(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在3’末端核苷酸的上游(c)3’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，第二引物的尾区包含与第一引物的尾区的核苷酸序列互补的核苷酸序列第二引物的模板结合区与步骤(A)的第一引物的第一拷贝的延伸产物退火，并且第二引物的延伸产物含有5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及包含3’末端核苷酸的3’末端区，其中该3’末端区含有与在5’至3’方向读取的第二引物的尾区的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且该3’末端区的最后的核苷酸是第二引物的延伸产物的3’末端核苷酸，(C)在使得合成与步骤(B)的第二引物的延伸产物退火的第一引物的第二拷贝的延伸产物的条件下，用第一引物的第二拷贝和聚合酶处理步骤(B)的第二引物的延伸产物，以产生包含步骤(B)的第二引物的延伸产物和第一引物的第二拷贝的延伸产物的二级核酸的第一拷贝，其中第一引物的第二拷贝的延伸产物含有5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及包含3’末端核苷酸的3’末端区，其中该3’末端区含有与在5’至3’方向读取的第一引物的尾区的核苷酸序列相同的核苷酸序列，并且该3’末端区的最后的核苷酸是第二引物的延伸产物的3’末端核苷酸，(D)将至少步骤(C)重复另外一次或多次以生成步骤(C)的二级核酸的至少第二拷贝，(E)在使得二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物的3’末端区与二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的3’末端区退火的条件下，处理步骤(C)的二级核酸的第一拷贝以及步骤(D)的二级核酸的第二拷贝，以产生包含二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物以及二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的交换结构，(F)在使得合成二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物的延伸产物以及合成二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的延伸产物的条件下，用聚合酶处理步骤(E)的交换结构，以产生包含步骤(A)的双链核酸模板的两个拷贝的多联体，其中该多联体包含二级核酸的第一拷贝的第一引物的第二拷贝的延伸产物的延伸产物以及二级核酸的第二拷贝的第二引物的延伸产物的延伸产物。30.如权利要求29所述的方法，其中步骤(A)的核酸聚合酶是具有链置换活性的DNA聚合酶。31.如权利要求29所述的方法，其中该方法的所有步骤均在不高于80℃的温度下进行。32.如权利要求29所述的方法，其中两个或更多个步骤同时进行。33.一种生成包含多核苷酸模板或其类似序列的两个或更多个拷贝的多联体的方法，该方法包括，(A)在使得合成与多核苷酸模板退火的第一引物的第一拷贝的延伸产物的条件下，用第一引物的第一拷贝和聚合酶处理包含多核苷酸模板的一级核酸，其中第一引物包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：(i)尾区，其包含(a)引物的5’末端核苷酸(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游(c)5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，以及(ii)模板结合区，其包括(a)引物的3’末端核苷酸(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在3’末端核苷酸的上游(c)3’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸，并且第一引物的第一拷贝的模板结合区与多核苷酸模板退火，(B)在使得合成与步骤(A)的第一引物的第一拷贝的延伸产物退火的第二引物的延伸产物的条件下，用第二引物和聚合酶处理步骤(A)的第一引物的第一拷贝的延伸产物，其中第二引物包含5’末端核苷酸、3’末端核苷酸以及两个区域：(i)尾区，其包含(a)引物的5’末端核苷酸(b)最内核苷酸，其中该最内核苷酸在5’末端核苷酸的下游(c)5’末端核苷酸与最内核苷酸之间的中间部分，该中间部分包含一个或多个核苷酸(i...
【专利技术属性】
技术研发人员：K·贝尔霍钦，J·李，P·帕特尔，A·理查德森，S·塔巴克曼，
申请(专利权)人：赛拉诺斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US
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