来自多能干细胞的心肌细胞群的制造方法技术

本发明专利技术提供一种在短时间内以简便的操作使用由多能干细胞向心肌细胞分化诱导后的细胞群来制造能够用于临床的、安全且损伤小的心肌细胞群的方法。本发明专利技术为心肌细胞群的制造方法，其包含：(1)将多能干细胞向心肌细胞分化诱导的工序，(2)使分化诱导后的细胞群与选自由层粘连蛋白α2β1γ1、层粘连蛋白α2β2γ1、层粘连蛋白α1β1γ1及层粘连蛋白α1β2γ1组成的组中的层粘连蛋白或者该层粘连蛋白的具有整联蛋白结合活性的片段接触的工序，及(3)回收附着于上述层粘连蛋白或上述片段的细胞的工序。

Method for producing cardiac muscle cell group from pluripotent stem cell

The invention provides a short time and simple operation by using cell group induced pluripotent stem cells to differentiate into cardiomyocytes after the manufacturing can be used for clinical, safety and method of myocardial cells and small damage. The invention relates to a method for manufacturing, myocardial cells comprising: (1) the pluripotent stem cells to induce myocardial cell differentiation process, (2) the differentiated cells induced and selected laminin alpha 2 beta 1 gamma 1, laminin alpha 2 beta 2 gamma 1, laminin alpha 1 beta 1 gamma 1 and laminin alpha 1 beta 2 gamma 1 group consisting of laminin or laminin with integrin binding activity of the fragment contact process, and (3) attached to the recovery of laminin fragments or the cell process.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】来自多能干细胞的心肌细胞群的制造方法
本专利技术涉及来自多能干细胞的心肌细胞群的制造方法。
技术介绍
作为由人多能干细胞向心肌细胞的分化诱导方法，已经报道了例如下述方法：使用激活素A和骨形成蛋白4(BoneMorphogeneticProtein4，BMP4)对在饲养细胞上维持培养的人多能干细胞进行分化诱导的方法(非专利文献1、2)，使用Wnt3a、R-Spondin-1及DKK1对在Matrigel上维持培养的人多能干细胞进行分化诱导的方法(非专利文献3)，使用生物反应器对在饲养细胞上维持培养的人多能干细胞大量地进行分化诱导的方法(非专利文献3)等。在进行由多能干细胞向心肌细胞的分化诱导时，通常会在批次间观察到该心肌细胞分化效率不稳定。在作为再生医疗的移植细胞源使用时，在作为移植细胞的心肌细胞纯度不满足基准值时则有必要对心肌细胞进行纯化。关于用于再生医疗的来自人多能干细胞的心肌细胞的纯度，有报道指出：并非必须以100％为目标，反而是70％左右时在功能性方面更良好(非专利文献4)。因此，将来自人多能干细胞的心肌细胞纯度小于70％的细胞群的心肌细胞纯度提高到70％左右，特别是在细胞治疗中的移植细胞制备中意义重大。此外，由于难以将心肌细胞分化效率在批次间调整到同一程度，因此可预测，在药物开发筛选研究中分化效率的批次间差异会影响结果的重复性。进而，为了灵敏地检测心肌细胞的药剂响应性，需要使除心肌细胞以外的细胞所产生的背景强度为最低限度。已经报道了几种提高分化诱导后的心肌细胞的纯度的方法，大体上可以分为两类方法。第一类方法为利用细胞营养缺陷的方法，即使用去除了除心肌细胞以外的细胞生存所必需的营养源的培养基进行培养，来除去心肌细胞以外的细胞。例如，专利文献1记载了用低葡萄糖浓度的培养基来提高心肌细胞的纯度的方法。但是，担心该方法不仅损伤除心肌细胞以外的细胞，连心肌细胞也会损伤显著。此外，还存在心肌细胞的挑选需要长时间(至少数天)的问题。第二类方法是用针对心肌细胞特异性表面抗原、糖链的抗体来分离获得心肌细胞的方法，即使用流式细胞术、磁珠的方法。但是，用流式细胞术分离获得细胞时，存在根据所需的细胞量而需要相当长的时间的问题。此外，存在担心使用流式细胞术、磁珠而使所回收的细胞损伤、污染的问题。因此，在像细胞移植这样需要大量细胞的情况下，采用该方法是不现实的。进而，使用该方法时，需要评价抗体、磁珠的残存，需要时间和功夫。如果检测到磁珠残存，则难以确保移植细胞的安全性。就纯化来自人多能干细胞的分化细胞来制备移植用细胞的理想方法而言，不仅要提高分化细胞的纯度、细胞收获量，而且要确保对于接受移植的人的安全性，同时可以制备出移植后可在体内发挥目标功能的细胞，这些都是不可或缺的。更理想的是，期望一种对细胞的损伤低、且可以在短时间内处理大量细胞的简单方法。但是，很难说通过目前报道的方法可以制备能够用于临床的细胞。因此，迫切需要开发出能够简便且大量地制备能够用于临床的细胞、即安全且损伤少的细胞的新方法。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2013-143968号公报非专利文献非专利文献1：YangLetal.,Nature,2008May22；453(7194):524-8,doi:10.1038/nature06894,Epub2008Apr23非专利文献2：TakahashiKetal.,Cell,2007Nov30；131(5):861-72非专利文献3：KawamuraMetal.,Circulation,2012Sep11；126(11Suppl1):S29-37非专利文献4：ThavandiranNetal.,ProcNatlAcadSciUSA.2013Dec3；110(49):E4698-707,doi:10.1073/pnas.1311120110,Epub2013Nov19
技术实现思路
专利技术所要解决的问题本专利技术的课题在于，提供一种在短时间内以简便的操作使用由多能干细胞向心肌细胞分化诱导后的细胞群来制造能够用于临床的、安全且损伤少的心肌细胞群的方法。用于解决问题的方法为了解决上述课题，本专利技术包括以下的各专利技术。[1]一种心肌细胞群的制造方法，其特征在于，包含：(1)将多能干细胞向心肌细胞分化诱导的工序，(2)使分化诱导后的细胞群与选自由层粘连蛋白α2β1γ1、层粘连蛋白α2β2γ1、层粘连蛋白α1β1γ1及层粘连蛋白α1β2γ1组成的组中的层粘连蛋白或者该层粘连蛋白的具有整联蛋白结合活性的片段接触的工序，及(3)回收附着于上述层粘连蛋白或上述片段的细胞的工序。[2]根据上述[1]所述的制造方法，其特征在于，还包含从分化诱导后的细胞群除去未分化细胞的工序。[3]根据上述[2]所述的制造方法，其特征在于，上述除去未分化细胞的工序设置在上述工序(1)和(2)之间，上述除去未分化细胞的工序包含：(A)使分化诱导后的细胞群与选自由层粘连蛋白α5β1γ1、层粘连蛋白α5β2γ1、层粘连蛋白α3β1γ1、层粘连蛋白α3β2γ1及层粘连蛋白α3β3γ2组成的组中的层粘连蛋白或者该层粘连蛋白的具有整联蛋白结合活性的片段接触的工序，及(B)回收未附着于上述层粘连蛋白或上述片段的细胞的工序。[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的制造方法，其特征在于，在上述工序(2)和/或工序(A)中，使包被在培养器具的培养面或载体上的层粘连蛋白或该层粘连蛋白的具有整联蛋白结合活性的片段与分化诱导后的细胞群接触。[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的制造方法，其中，层粘连蛋白的具有整联蛋白结合活性的片段为层粘连蛋白E8片段。[6]根据上述[5]所述的制造方法，其中，层粘连蛋白E8片段的包被浓度为0.1μg/cm2～2μg/cm2。[7]根据上述[5]或[6]所述的制造方法，其中，上述工序(2)中的接触时间为15分钟～180分钟。[8]根据上述[5]～[7]中任一项所述的制造方法，其中，上述工序(A)中的接触时间为5分钟～30分钟。[9]根据上述[1]～[8]中任一项所述的制造方法，其中，心肌细胞群的心肌细胞的纯度为50％～90％。[10]一种提高由多能干细胞向心肌细胞分化诱导后的细胞群的心肌细胞的纯度的方法，其特征在于，包含以下工序1及工序2，工序1：使选自由层粘连蛋白α2β1γ1、层粘连蛋白α2β2γ1、层粘连蛋白α1β1γ1及层粘连蛋白α1β2γ1组成的组中的层粘连蛋白或该层粘连蛋白的具有整联蛋白结合活性的片段与上述细胞群接触的工序，工序2：回收附着于上述层粘连蛋白或上述片段的细胞的工序。[11]根据上述[10]所述的方法，其中，上述具有整联蛋白结合活性的片段为层粘连蛋白E8片段。专利技术效果根据本专利技术，可以在短时间内以简便的操作使用由多能干细胞向心肌细胞分化诱导后的细胞群来制造能够用于临床的、安全且损伤少的心肌细胞群。此外，根据本专利技术，可以在短时间内以简便的操作提高由多能干细胞向心肌细胞分化诱导后的细胞群的心肌细胞的纯度。附图说明图1是示出研究使用人层粘连蛋白E8片段(511E8、311E8、332E8)来除去由人iPS细胞分化诱导成心肌细胞的细胞群中的未分化细胞的结果的图。图2是示出将人层粘连蛋白511E8片段对未分化细胞的特异性与本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种心肌细胞群的制造方法，其特征在于，包含：(1)将多能干细胞向心肌细胞分化诱导的工序，(2)使分化诱导后的细胞群与选自由层粘连蛋白α2β1γ1、层粘连蛋白α2β2γ1、层粘连蛋白α1β1γ1及层粘连蛋白α1β2γ1组成的组中的层粘连蛋白或者该层粘连蛋白的具有整联蛋白结合活性的片段接触的工序，及(3)回收附着于所述层粘连蛋白或所述片段的细胞的工序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.16 JP 2014-1881801.一种心肌细胞群的制造方法，其特征在于，包含：(1)将多能干细胞向心肌细胞分化诱导的工序，(2)使分化诱导后的细胞群与选自由层粘连蛋白α2β1γ1、层粘连蛋白α2β2γ1、层粘连蛋白α1β1γ1及层粘连蛋白α1β2γ1组成的组中的层粘连蛋白或者该层粘连蛋白的具有整联蛋白结合活性的片段接触的工序，及(3)回收附着于所述层粘连蛋白或所述片段的细胞的工序。2.根据权利要求1所述的制造方法，其特征在于，还包含从分化诱导后的细胞群除去未分化细胞的工序。3.根据权利要求2所述的制造方法，其特征在于，所述除去未分化细胞的工序设置在所述工序(1)和(2)之间，所述除去未分化细胞的工序包含：(A)使分化诱导后的细胞群与选自由层粘连蛋白α5β1γ1、层粘连蛋白α5β2γ1、层粘连蛋白α3β1γ1、层粘连蛋白α3β2γ1及层粘连蛋白α3β3γ2组成的组中的层粘连蛋白或者该层粘连蛋白的具有整联蛋白结合活性的片段接触的工序，及(B)回收未附着于所述层粘连蛋白或所述片段的细胞的工序。4.根据权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其特征在于，在所述工序(2)和/或工序(A)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：越智悠基子，关口清俊，宫川繁，泽芳树，安蒂·马库斯·西尔塔宁，
申请(专利权)人：国立大学法人大阪大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP