去整合蛋白变异体及其医药用途制造技术

专一性结合至一个或多个α5β1及αv整合蛋白(例如αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6及αvβ8)，但具有与αIIbβ3的降低结合活性的去整合蛋白变异体；以及该去整合蛋白变异体在治疗和预防一与αv整合蛋白或α5β1整合蛋白相关的疾病上的用途。

Recombinant protein variants and their pharmaceutical use

Specific binding to one or more alpha 5 beta 1 and alpha v (e.g. integrin alpha v beta 1 and alpha v beta 3 and alpha v beta 5 and alpha v beta 6 and alpha v beta 8), but can be combined with alpha IIb beta 3 integrin variants to reduce activity; and use of the disintegrin variants in the treatment and prevention of a V protein with alpha integration or alpha 5 beta 1 integrin associated diseases on.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】去整合蛋白变异体及其医药用途优先权声明本申请案依美国专利法35U.S.C.§119(e)主张于2014年8月22日提出申请的美国临时专利申请案第62/040，503号的权益，该美国临时专利申请案的全文并于此处以供参考。参见电子送件序列表本申请案包括一通过EFS-Web电子送件的序列表，该序列表为ASCII格式，档名为“688947-1PCTSequenceListing.txt”，建档日期为2015年8月20日，档案大小为157，219字节。该通过EFS-Web电子送件的序列表为本说明书的一部分，且全文并于此处以供参考。
本专利技术关于去整合蛋白变异体，其专一性结合至一个或多个α5β1及αv整合蛋白(例如αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、及αvβ8)，但具有与αIIbβ3的降低结合活性，以及该去整合蛋白变异体在治疗和预防与αv整合蛋白或α5β1整合蛋白相关的疾病上的用途。
技术介绍
整合蛋白与邻近细胞上的膜外基质蛋白或其它黏着受器结合的穿膜受器。整合蛋白的α及β次单元的异二聚物配对(heterodimericpairing)赋予与一个或多个基质结合的专一性(Weis等人，2011，ColdSpringHarbPerspectMed；1：a006478)。这个家族的黏着分子在生物学广泛的领域中扮演一重要的角色，包括发炎、先天性及抗源专一性免疫、恒定、伤口痊愈、组织成形(tissuemorphogenesis)及细胞生长与分化的调控。整合蛋白的异常调控涉及于很多疾病状态(从自体免疫至血管栓塞疾病，再到癌症转移)的致病机转。业经投入广大的努力于发现和开发用于临床应用的整合蛋白拮抗剂。这些αv整合蛋白各自具有一αv次单元与一β1、β3、β5、β6或β8次单元配对，其等似乎在有关伤口修复、血管新生及癌症的组织改造(tissueremodeling)过程中特别地重要(Weis等人，2011，见上文)。这些αv整合蛋白可做为癌症、眼科及骨科的适应症的标靶。整合蛋白αvβ3及αvβ5也与肿瘤、关节炎、干癣及老年性黄斑病变(age-relatedmaculardegeneration,AMD)有关。特别是，αvβ3整合蛋白在调节血管新生及抑制肿瘤转移中是重要的，且αvβ6整合蛋白在一些癌症中是增量表现的。其它存在于眼角膜中的αv整合蛋白(αvβ5、αvβ6及αvβ8)调节转化生长因子β(transforminggrowthfactorβ,TGFβ)的活化。整合蛋白α5β1、αvβ3及αvβ5已被报告其在血管新生的过程中扮演一重要角色且在多种恶性肿瘤中表现，包括(但不限于)黑色素瘤、乳癌、前列腺癌、结肠癌及脑瘤(Staunton等人，2006，AdvImmunol.，91：111-57)。这些整合蛋白的肿瘤内表现(intratumoralexpression)与肿瘤(例如黑色素瘤、乳癌、及前列腺癌)的发展与转移相关(Staunton等人，2006，见上文)。其等已被显示通过多条途径传讯且帮助内皮细胞的转移与增生。在生物体内，其等在肿瘤的新生血管及肿瘤细胞自身上过度表现，此暗示其功能可通过多种机制使肿瘤的发展成为可能。对抗整合蛋白α5β1、αvβ3及αvβ5的拮抗性抗体及小分子在生物体外和在生物体内已显示可抑制血管新生。整合蛋白α5β1、αvβ3及αvβ5的抑制因子可以抑制通过ERK、Akt及FAK的传讯，导致内皮细胞及癌细胞的黏着、转移及增生减少。这些拮抗剂也被发现通过凋亡蛋白酶依赖(caspase-dependent)机制引起细胞凋亡。因此，整合蛋白α5β1、αvβ3及αvβ5在血管新生的关键性角色及与肿瘤发展的关联使其成为抗癌疗法的有吸引力的目标，且这些整合蛋白的许多拮抗剂已于临床试验测试。αvβ3整合蛋白与αIIbβ3整合蛋白享有相同的β3次单元以及多个大分子配体(ligand)，包括血纤维蛋白原(fibrinogen)、纤维连接蛋白(fibronectin)、凝血栓蛋白(thrombospondin)、温韦伯氏因子(vonWillebrandfactor)及玻璃黏结蛋白(vitronectin)。这些配体都含有三重组氨基酸序列：精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)。纤维连接蛋白及玻璃黏结蛋白也为α5β1及其它αv整合蛋白的配体。αIIbβ3整合蛋白为血小板上的一主要膜蛋白，且在血小板的凝集上扮演一重要的角色。多种αIIbβ3整合蛋白拮抗剂业经开发用于治疗患有急性冠心症(acutecoronarysyndrome,ACS)的病人。然而，因为广泛地抑制血小板凝集伴随出血风险的增加，发展中的研究着重于减少出血及其它αIIbβ3整合蛋白拮抗剂的副作用。通过阻断单一整合蛋白或者多重αv整合蛋白设计用于不同适应症的药物是必须的(Goodman，2012，TrendsPharmacolSci.2012；33：405-412)。去整合蛋白是一含RGD的低分子量胜肽家族，其与表现在血小板及其它细胞(包括血管内皮细胞及一些肿瘤细胞)上的整合蛋白(例如αIIbβ3、α5β1、及αvβ3)结合。除了其有效的抗血小板活性外，去整合蛋白的研究已呈现在心血管疾病的诊断中以及在动脉栓塞、骨质疏松及血管新生相关的肿瘤生长及转移的治疗药剂的设计中的新用途。马来亚蝮素(Rhodostomin，Rho)，一种来自马来亚蝮蛇的毒液的去整合蛋白，业经发现通过阻断血小板醣蛋白αIIbβ3以在生物体外及生物体内抑制血小板凝集。也发现，Rho可与整合蛋白αIIbβ3、α5β1及αvβ3以高亲和力结合且与癌细胞互相作用。举例而言，Rho被报告其以剂量依存的方式抑制乳房及前列腺恶性肿瘤细胞对未矿物化及矿物化的骨细胞外基质的黏着性，但其不影响肿瘤细胞的存活力。Rho也可抑制乳房及前列腺恶性肿瘤细胞的转移及入侵。然而，由于马来亚蝮素非专一性地与整合蛋白αIIbβ3、α5β1及αvβ3结合，马来亚蝮素的医药用途可能造成严重的副作用，例如因抑制血小板凝集造成出血。因此，在本
中存在对整合蛋白α5β1及αvβ3具选择性但对αIIbβ3具有降低的结合活性的去整合蛋白变异体的需求。本专利技术可满足此一需求。
技术实现思路
本专利技术关于在一个或多个去整合蛋白(例如马来亚蝮素)的连接符区域、RGD环及C-端中，具有一个或多个突变的去整合蛋白变异体，其具有对αIIbβ3整合蛋白降低的结合活性，因而对血小板凝集造成弱抑制，但却与一个或多个α5β1及αv整合蛋白(例如αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、及αvβ8)专一性地结合。因此，在一总体方面上，本专利技术关于一包含选自由以下所组成的群组的至少一个的去整合蛋白变异体：(a)一突变连接符(mutantlinker)，其包含至少一位于SEQIDNO：332(SRAGKIC)氨基酸序列的1至5位点上的突变；(b)一突变RGD环(mutantRGDloop)，其包含选自由SEQIDNO：329至331所组成的群组的氨基酸序列；以及(c)一突变C-端(mutantC-terminus)，其包含至少一位于SEQIDNO：334(PRYH)氨基酸序列的1至4位点上的突变，其中，相较于一不具有选自由该突变连接符、该突变RGD环以及该突变C-端本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种去整合蛋白变异体，其特征在于，其包含选自由以下所组成的群组的至少一个：(a)一突变连接符，其包含至少一位于SEQ ID NO：332(SRAGKIC)氨基酸序列的1至5位点上的突变；(b)一突变RGD环，其包含选自由SEQ ID NO：329至331所组成的群组的氨基酸序列；以及(c)一突变C‑端，其包含至少一位于SEQ ID NO：334(PRYH)氨基酸序列的1至4位点上的突变，其中，相较于一去整合蛋白不具有该选自由该突变连接符、该突变RGD环以及该突变C‑端所组成的群组的至少一个，该去整合蛋白变异体具有以下至少一个：降低与αIIbβ3整合蛋白的结合活性以及提高与αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、及α5β1整合蛋白中的至少一个的结合活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.22 US 62/040,5031.一种去整合蛋白变异体，其特征在于，其包含选自由以下所组成的群组的至少一个：(a)一突变连接符，其包含至少一位于SEQIDNO：332(SRAGKIC)氨基酸序列的1至5位点上的突变；(b)一突变RGD环，其包含选自由SEQIDNO：329至331所组成的群组的氨基酸序列；以及(c)一突变C-端，其包含至少一位于SEQIDNO：334(PRYH)氨基酸序列的1至4位点上的突变，其中，相较于一去整合蛋白不具有该选自由该突变连接符、该突变RGD环以及该突变C-端所组成的群组的至少一个，该去整合蛋白变异体具有以下至少一个：降低与αIIbβ3整合蛋白的结合活性以及提高与αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、及α5β1整合蛋白中的至少一个的结合活性。2.如权利要求1所述的去整合蛋白变异体，其特征在于，该去整合蛋白选自由以下所组成的群组：马来亚蝮素、白唇竹叶青蛇素、百步蛇素、墨西哥西海岸响尾蛇素、矛头蝮素、鼓腹巨蛇素、西部亚种响尾蛇素、角响尾蛇素、西部菱背响尾蛇素、南美响尾蛇素、丽纹龟壳花蛇素、黄绿龟壳花蛇素、黄绿龟壳花蛇毒解离素、日本蝮蛇素、西伯利亚蝮蛇毒解离素、巴西蝮素、巴西蝮蛇毒解离素、马来亚红口蝮素、亚马逊巨蝮素、西部亚种响尾蛇素、黑尾响尾蛇素、韩国亚种短尾蝮素、白眉蝮素、北美侏儒响尾蛇素、黄绿龟壳花蛇毒解离素、台湾龟壳花素、台湾龟壳花去整合蛋白、乌苏里蝮素及草原响尾蛇素。3.如权利要求1或2所述的去整合蛋白变异体，其特征在于，其包含一突变RGD环、以及该突变连接符及该突变C-端中的至少一个，该突变RGD环包含至少一位于SEQIDNO：333(RIPRGDMP)氨基酸序列的1至3、5、7及8位点上的突变。4.如权利要求1至3中任一项所述的去整合蛋白变异体，其特征在于，该突变连接符包含选自由SEQIDNO：306至SEQIDNO：318所组成的群组的氨基酸序列。5.如权利要求1至4中任一项所述的去整合蛋白变异体，其特征在于，该突变C-端包含选自由SEQIDNO：319至SEQIDNO：328所组成的群组的氨基酸序列。6.如权利要求1至6中任一项所述的去整合蛋白变异体，其特征在于，其包...

【专利技术属性】
技术研发人员：庄伟哲，
申请(专利权)人：成功大学，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71