一种变性重组蛋白质高通量重折叠复性方法技术

本发明专利技术涉及一种变性重组蛋白质高通量重折叠复性方法；以不溶性变性蛋白质的包涵体为原料，采用人工分子伴侣－去污剂－阻凝剂三联复性系统，过程如下：将包涵体使用含去污剂和阻凝剂尿素或胍缓冲液使包涵体变成一级结构的伸展态，形成蛋白质－去污剂复合物；加入脲或胍缓冲液稀释１０～５０倍，再加入含分子伴侣和氧化还原系统的脲或胍缓冲液，逐步释放出伸展态的蛋白质结构；使用平行分离柱纯化重折叠复性的重组蛋白质，浓缩或冷冻干燥；本发明专利技术的优点是有待复性蛋白质浓度高，所用反应容器体积小，对于各种表达系统所形成的包涵体或变性蛋白质均有效，效率提高数倍乃至几十倍；方法简便，适用于蛋白质组工程研究，条件易优化，产业化前景好。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及变性蛋白质(包涵体)的重折叠复性，具体地说是。
技术介绍
20世纪的最后一年，人类基因组计划的完成，生命科学的工业化以迅猛的速度跨越式地进入了一个崭新的时代，即后基因组时代；基因组工程的各种新兴学科，交叉学科应运而生，生物技术的发展犹如长江之水，一日千里，正在形成一个宏观的称之为“生命科学工业”，而不仅仅局限于生物技术或生物工程
了；然而，生命的本质在于蛋白质，在了解到人类只有不到40,000个基因的同时，许多科学家正在为探索这一本质做出不懈的努力和创造。尽管，全球已有近4000种重组蛋白质已经被制备，但是能用于直接表达和制备的蛋白质不到25％，大部分基因工程菌(大肠杆菌或真菌)表达的重组蛋白质是作为变性的包涵体(Inclusion Body)形式分泌出细胞，以不溶解的凝聚物存在。这就使获得大量重组人体功能蛋白质成为生命科学工业发展的瓶颈。因此，开发毫克级乃至克级的高通量蛋白质分离纯化技术成为当前生命科学工业界的一大热点。大肠杆菌原核表达系统已成为生物实验室或生物技术公司日常的工作，其原因是大肠杆菌便宜易得，蛋白质合成高效，工艺成本比脯乳动物、昆虫和真菌系统相对便宜而高效；对一些有细胞毒的蛋白质，可以通过该系统快速得到大量重组蛋白质，过量表达对于大肠杆菌并不造成伤害；重组后不溶蛋白质稳定，易于保存；可以避免其他系统所表达的重组蛋白质的降解，不稳定等问题。利用经典的细胞破壁(溶菌酶或机械法，lysozymeor French Press)、离心(10,000xg低速离心)，再经冻融和用不同的缓冲洗液洗涤法可高效地得到变性的包涵体(Krueger，J.K.等Biopharm，1989，340-45)。这样可以较容易地获得高于90％纯度的不溶蛋白质包涵体；由于众多的基因分子文库已经商业化，这样可以用这一常规法快速建立重组人体蛋白质包涵体分子文库备用。其关键是变性蛋白质(包涵体)的重折叠复性技术，尤其是做到高通量的重折叠是工业界急需解决的难题之一。蛋白质折叠是个复杂的过程，体内维持蛋白质的三维结构与细胞的内环境有很大关系，可以是分子伴侣、或其他辅助物质的调节；然而，体外重折叠方法，除了使用常规热力学调节机制之外(如控制浓度、压力，pH值等)，常见的重折叠复性方法包括稀释法和渗透法。但是，在许多情况下，由于折叠复性的中间产物较易形成凝聚体(Aggregates)，常常很难拿到活性蛋白质；新近通过转向于体内蛋白质折叠的模拟，产生了一些新的方法，例如使用分子伴侣蛋白质GroEL在体内具有结合蛋白质的作用，相当于变性蛋白质的亲和配基；固定化GroEL柱(固定床)相当于变性蛋白质的亲和吸附层析柱，从而可提高样品的处理量，并使蛋白质在复性的同时得到浓缩和纯化，其特点在于1)不仅可以解决分子伴侣的重复利用问题，而且由于固定床的利用(近于平推流)，可提高分子伴侣的利用效率；2)由于采用连续操作，原料处理量大，产品可以得到浓缩、纯化；3)易于建立相关的模型，对于放大生产具有重要的指导作用；Teshima等利用固定化分子伴侣，在体外辅助了淀粉酶、碳酸酐酶、DNA酶的折叠复性(Teshima T等.Appl Microbiol Biotech，1997，4841-46)，其他备受关注的适用于蛋白质重折叠的分子伴侣还包括蛋白质二硫健异构酶(多肽脯氨酸顺式-反式异构酶，Peptidyl Proly Cis-Trans Isomerase，简称PPI)，GroEL，GroES，DnaJ，DnaK；还有报道利用“小分子伴侣”对目标蛋白质进行复性(Zahn R等.Proc Nail Acad Sci USA，1996，9315024-15029)，“小分子伴侣”是指GroEL的一个片段，而这个片段并不是GroEL的水解产物，而是由基因重组后包括GroEL191-345氨基酸残基片段(16.7kD)或191-376氨基酸残基片段(21kD)密码的基因片段在大肠杆菌中的表达产物，它们能有效地促进亲环蛋白A、硫氰酸酶以及芽孢杆菌RNA酶的复性；由于“小分子伴侣”分子较小，更适合于固定化，且不需另加复性辅助因子(如GroES和ATP等)，因此具有很大的应用前景；但是，由于这些分子伴侣均需特别制备技术，对于大规模多种蛋白质制备，仍属昂贵试剂。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种成本低、可调控的适于规模化应用的变性重组蛋白质高通量重折叠复性方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为以价廉的人工分子伴侣体系“三合一”法、以不溶性变性蛋白质(包涵体)(或商业用酶)为原料，采用人工分子伴侣-去污剂-阻凝剂三联复性系统分离提纯重组蛋白质，具体操作过程如下1)在4～36℃温度下，将多次洗涤纯化后包涵体(纯度＞90％)(较好的方法参见Babbit，P.C.等Biotechnology 1990，8945-949；Wong，H.H.等Bioseparation 1996，6185-192)用6-8M尿素或3-7M胍缓冲液使包涵体变成一级结构的伸展态，其中含有蛋白质重量0.1～0.5％(w/v)去污剂和0.4～0.6M阻凝剂，0.5～5小时后，形成伸展态蛋白质-去污剂复合物在变性蛋白质溶液中加入去污剂和阻凝剂，通过与蛋白质形成复合体，抑制肽链间的相互聚集；加入去污剂(紫外分析检测A280)至无游离伸展态蛋白质；2)加入1～2M尿素或胍缓冲液稀释10～50倍，使蛋白质浓度为0.1～10毫克/毫升，时间0.5～2小时(用复性液稀释至理想复性浓度)；根据具体蛋白质而定，80％的包涵体为还原态，对于已知含有非还原态巯基的包涵体，可加入过量的谷胱甘肽在缓冲溶液中作为弱还原剂，以维持所有去折叠的包涵体处于还原肽；除在纯化包涵体时，充分除去膜蛋白和细胞壁一样重要，维持还原态是获得高产率的复性重组蛋白质的关键；3)加入含有浓度为20～100mM(毫摩尔浓度)分子伴侣和氧化还原系统的1～2M尿素或胍缓冲液，逐步释放出伸展态的蛋白质结构，时间3～5小时内复性，个别需～1周；脉冲法控制(可于90～120分钟内间歇式或梯度式)加入含有分子伴侣的缓冲液速度，逐步释放出伸展态的蛋白质一级结构，保持同时抑制错误折叠和包涵体再生，使游离出的蛋白质伸展态浓度达到理想的，利于分子内反应的浓度；控制一级结构蛋白质从去污剂-复合物上剥离下来的速度，变为部分折叠即不含去污剂分子的非活性状态PFP，进一步完成正确折叠蛋白质的复性，从而折叠为天然活性蛋白质NP。4)使用各种平行分离柱纯化重折叠复性的重组蛋白质，浓缩或冷冻干燥(以蛋白质溶液或固体方式，分别在4℃，-20℃，或-80℃储存)；所述分子伴侣为α-环糊精、β-环糊精或甲基-β-环糊精。包涵体去折叠脲缓冲液组成为6-8M脲、1-5mM EDTA(乙二氨四乙酸二钠)、0.1M 2-Me、20mM NaOAc；胍缓冲液组成为3-7M胍、150mM的磷酸钠、25mM DTT(二硫苏糖醇)、10mM MgCl2和10mM KCl、pH5-7.6。缓冲液中可同时加入0.1-0.5％的去污剂和阻凝剂0.4-0.6M精氨酸，0.05％聚乙二醇(3550-5000分子量)所述去污剂为十二烷基磺酸钠，十六烷基三甲氨溴化氢季氨盐(CTAB)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种变性重组蛋白质高通量重折叠复性方法，其特征在于：以不溶性变性蛋白质的包涵体为原料，采用人工分子伴侣－去污剂－阻凝剂三联复性系统分离提纯重组蛋白质，具体操作过程如下：１）在４～３６℃温度下，将洗涤纯化的包涵体，使用６～８Ｍ尿素或３ ～７Ｍ胍缓冲液，使包涵体变成一级结构的伸展态，其中缓冲液含有０．１～０．５％的去污剂和０．４～０．６Ｍ阻凝剂，０．５～５小时后，形成伸展态蛋白质－去污剂复合物；２）加入１～２Ｍ尿素或胍缓冲液稀释１０～５０倍，使蛋白质浓度为０．１～１ ０毫克／毫升，时间０．５～２小时；３）加入含有浓度为２０～１００ｍＭ人工分子伴侣４～６当量和氧化还原系统的１～２Ｍ脲或胍缓冲液，逐步释放出伸展态的蛋白质结构，时间为３小时～１周；所述分子伴侣为：α－环糊精、β－环糊精或甲基－β－环糊 精４）使用平行分离柱纯化重折叠复性的重组蛋白质，浓缩或冷冻干燥。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梅晓丹，谢岩生，郭晓迪，刘进前，张利平，
申请(专利权)人：大连百奥科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]