含硒多肽及其在药物、食品等方面的应用制造技术

本发明专利技术属于生物化学领域，具体涉及一种含特定肽序列的自由基清除剂含硒多肽及该多肽在药物、食品等方面的应用。本发明专利技术所公开的含硒多肽具有天然谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＰＸ）的底物ＧＳＨ结合位点和利于催化的疏水微环境结构，通式为Ｑ↓［１］－Ａｒｇ－Ｑ↓［２］－Ａｒｇ－Ｑ↓［３］－Ａｌａ（Ｇｌｙ）－ＳｅｒＳｅ－ＳｅｒＳｅ－Ａｌａ（Ｇｌｙ）－Ｑ↓［３］－Ａｒｇ－Ｑ↓［２］－Ａｒｇ－Ｑ↓［１］，其特征是两个多肽分子间通过硒桥（－Ｓｅ－Ｓｅ－）连接。该多肽具有很高的ＧＰＸ活力，能有效地清除人体内的自由基，可用于预防和治疗心脑血管疾病、糖尿病、肝脏损伤、呼吸系统疾病、风湿与类风湿、皮肤病、肿瘤等由自由基紊乱诱引发的疾病，在医药领域具有巨大的应用潜力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化学领域，具体涉及一种含特定肽序列的自由基清除剂含硒多肽及该含硒多肽在药物、食品等方面的应用。
技术介绍
谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是在哺乳动物体内发现的第一个含硒酶，它于1957年被Mills首先发现，1973年由Flohe和Rotruck两个研究小组确立了GPX与硒之间的联系；研究表明硒是GPX催化反应的必要组份，它以硒代半胱氨酸(Sec)的形式发挥作用，催化谷胱甘肽(GSH)分解体内的氢过氧化物，分子生物学和遗传学的证据都表明许多疾病的发生、发展都和活性氧自由基(ROS)有关，如糖尿病、白内障、克山病、心脑血管疾病和炎症等，并且在发病过程中GPX的活力都不同程度的下降，而适当的补充外源的GPX可以对病情缓解或达到治疗的目的。由此看来，GPX将是一种非常有前景的抗氧化药物。但是，自然界存在的GPX来源有限，在体外条件下极不稳定易失去酶的活力，天然的GPX容易引起机体的免疫反应，编码GPX活性基团硒代半胱氨酸(Sec)的三联体密码为终止密码子很难用基因工程的方法获得，上述这些缺点极大的限制了GPX的开发和利用。因而设计合成具有清除ROS能力的抗氧化酶模拟物受到了学术界的广泛关注。高活力的GPX人工酶极有可能成为未来预防和治疗由ROS介导的疾病的有效药物。面对这样一个非常有应用前景的抗氧化物质，许多科学工作者开始进行人工模拟并对其生物学效应进行研究。早期的GPX模拟物由于没有考虑到底物的结合作用，酶活力普遍很低，Ebselen(PZ51)就是其中一例，活力仅为0.99U/μmol。Wilson等人考虑到GSH的结合作用对酶活力的影响，在二硒键邻近处引入季胺盐，对GSH产生静电吸引，使所制备的GPX模拟物二苯基二硒化合物活力提高到11U/μmol。Hilvert等人将枯草杆菌蛋白酶硒化为GPX模拟物，此硒化枯草杆菌蛋白酶对合适巯基底物3-羧基-4-硝基苯硫酚的催化效率为二苯二硒化合物的7×104倍，而对GPX天然底物GSH的活力却很低。因此，对GPX的模拟关键是创造合适的GSH结合部位。以上结果说明模拟GPX要充分考虑产生GSH特异性结合部位，并提高对GSH的结合能力。由于GPX具有很强的抗氧化作用，这使它的模拟物具有很大的药用潜力，但一些活力较高的模拟物都是大分子物质，分子量通常都高于30kDa，这给这些模拟物的药物开发带来了很大的困难，因此寻找一种分子量相对较小，同时又具有高活力的模拟物势在必行。目前，有一种新兴的噬菌体展示肽库技术对于产生底物结合位点是很有帮助的。这种技术是以噬菌体颗粒为载体，利用天然蛋白质合成系统，将随机合成的编码任意顺序多肽的寡核苷酸序列插入线性噬菌体外壳蛋白基因组中，使其以融合蛋白的形式表达于噬菌体颗粒的外表面上，再通过与固定化的靶分子的相互作用来筛选靶分子的亲合配体，从而进行分子识别研究的一项新的实验技术。这种技术对于研究蛋白与蛋白、酶与底物间的相互作用是非常有用的一种工具，文献中报道了两种噬菌体展示肽库的生物体系对底物的优化，一种是单价表达载体，另一种是多价表达载体。常用的噬菌体载体是丝状噬菌体，寡核苷酸序列插入在噬菌体外壳蛋白III和VIII的N-未端。pVIII蛋白是噬菌体的主要外壳蛋白，每个噬菌体颗粒约有2700个拷贝，pIII蛋白是噬菌体的次要外壳蛋白，每个噬菌体颗粒约有5个拷贝。就pIII和pVIII蛋白而言，在基因克隆操作上，蛋白融合基本是相同的，在信号肽与成熟蛋白编码区之间设置单一的克隆位点，以便外源蛋白的插入，插入此位点的DNA片段以融合蛋白的形式被表达，并分泌到周质腔，去除N-端的信号肽后，融合蛋白就组装在成熟的噬菌体颗粒表面并释放到培养介质中，融合在N-末端的外源肽将被展示在噬菌体的外表面。在噬菌体肽库的亲和筛选过程中，pIII蛋白因其拷贝数低，降低了多结合位点的影响，有利于筛选出高亲和性的噬菌体肽，所以成为肽库构建的首选蛋白质载体。1985年，Smith等第一次证实了丝状噬菌体的基因组能通过基因工程的手段将外源抗原决定簇与其次要外壳蛋白融合并同时展示在噬菌体表面，几年后，Smith小组又证明被表达在噬菌体外壳上的抗原决定簇能够被特异性抗体所识别，1990年Smith和Parmely构建了噬菌体展示肽库。噬菌体展示肽库技术作为一种新兴的技术，它具有巨大的应用潜力，插入片段的多样性使噬菌体展示肽库可以在与分子识别、蛋白质间相互作用等相关领域广泛应用。1976年，Atassi与他的同事共同提出了“表面模拟”合成(Surface-simulationsynthesis)的技术，利用这种技术可以将构成蛋白质结合位点的空间相连的氨基酸残基直接通过肽键结合，在构象上模拟蛋白质结合位点。我们通过噬菌体肽库技术得到底物GSH的结合位点，结合上述的“表面模拟”合成技术的理论对短肽进行设计，并配合化学突变技术产生催化活性中心，从而获得一种新的具有GPX活力的短肽。因此在本专利技术中我们使用噬菌体展示肽库技术获得一种能够识别GSH的短肽，结合上述的“表面模拟”合成技术的理论对短肽进行设计，并配合化学突变技术，从而获得新的具有GPX活力的短肽。我们通过噬菌体肽库技术得到底物GSH的结合位点，结合上述的“表面模拟”合成技术的理论对短肽进行设计，并配合化学突变技术产生催化活性中心，从而获得一种新的具有GPX活力的短肽。这种模拟物具有很强的抗氧化作用，因此具有很大的药用潜力。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种含硒多肽以及该产品在药物、食品等方面的应用。为了更好的模拟天然GPX的活性，人们对其结构进行了研究。GPX是一种寡聚蛋白，由四个相同的亚基组成。根据X-射线晶体衍射结构分析结果，GPX一个亚基的30～40，140～150，63～70与另一亚基的63～69位氨基酸残基在表面形成一个扁平的凹槽，硒代半胱氨酸就位于这个凹槽底部，是酶的催化中心，该凹槽区是酶分子的活性部位，一个酶分子有4个这样的活性部位。从GPX的二级结构中得知，硒代半胱氨酸位于α1螺旋的N端。α1螺旋与邻近的两个平行的β折叠片(β1，β2)形成了βαβ型超二级结构，这种结构对活性部位提供了有利的空间构型，此外，硒代半胱氨酸残基附近的一些含芳香侧链的氨基酸(Phe，Trp)与Gln-7一同对硒代半胱氨酸起稳定作用。GPX活性部位附近的氨基酸排列顺序非常保守。其中Arg-167、Arg-40、Gln-130、Trp-148在酶与底物结合的过程中起着重要的作用，GSH的γ-谷氨酰基与Arg-167吻合形成盐桥，N-末端Gly的羧基与Arg-40形成另一盐桥，Trp-148和Phe-150等一些芳香族氨基酸残基在活性中心附近形成一个局部疏水环境，促进酶分子与底物的结合，而Trp-148和Glu-70上的氮原子可以和硒氢基形成氢键，使活性中心在结构上保持某种程度的稳定，如图1所示。我们通过噬菌体肽库技术得到对底物GSH具有较高结合能力的肽段，结合“表面模拟”合成技术的理论对短肽进行设计，并配合化学突变技术产生催化活性中心，从而获得一种新的具有GPX活力的多肽。本专利技术涉及的制备含硒多肽所使用的多肽的结构通式如(I)所示Q1-Arg-Q2-Arg-Q3-Ala(Gly)-Ser(I)式中Q1表示选自本文档来自技高网...

【技术保护点】
结构如（Ⅰ）所示的多肽，Ｑ↓［１］－Ａｒｇ－Ｑ↓［２］－Ａｒｇ－Ｑ↓［３］－Ａｌａ（Ｇｌｙ）－Ｓｅｒ（Ⅰ）式中Ｑ↓［１］表示选自Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ和Ｌｅｕ中的２个以上相同或不同的氨基酸残基；Ｑ ↓［２］表示至少包含Ｇｌｙ在内的１个以上的任意氨基酸残基；Ｑ↓［３］表示包含１个以上的任意氨基酸残基。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：罗贵民，孙晔，吕绍武，牟颖，闫岗林，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]